中红侧沟茧蜂Microplitis mediator小G蛋白Rho1的功能研究

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寄生蜂是一类寄生性昆虫,可以寄生许多农林害虫,因此作为天敌昆虫被广泛应用于农林害虫的生物防控中。中红侧沟茧蜂Microplitis mediator属于膜翅目茧蜂科,是一种寄主范围广泛的容性内寄生蜂。中红侧沟茧蜂携带多种寄生因子,如毒液和多分病毒(Polydnavirus,PDV),这些寄生因子能够调控寄主昆虫的免疫及生长发育等多种生理过程。在中红侧沟茧蜂中,毒液作为重要的寄生因子,其组分以及功能尚不清楚。本文利用转录组和蛋白质组技术分析鉴定了中红侧沟茧蜂毒液的组分;利用i TRAQ蛋白定量分析方法检测了寄生后棉铃虫血淋巴蛋白含量的差异,发现寄生蜂的小G蛋白Rho1存在于寄生后的棉铃虫血淋巴中;进一步利用RNA干扰和蛋白质互作等方法对Rho1的功能进行了研究。结果如下:1、中红侧沟茧蜂组学分析通过中红侧沟茧蜂转录组文库测序及分析,得到18,883个unigenes,其中10731个得到注释。通过对毒液蛋白组的分析,在毒腺蛋白(VA,venom apparatus,整个毒腺组织)和毒液蛋白(VR,venom reservoir,仅毒囊中的毒液)样品中分别得到2264和321个蛋白。对这些蛋白进行注释,发现它们与已鉴定的其它寄生蜂的毒液蛋白具有很高的相似性,主要分为四类:酶类、酶抑制剂类、神经类麻痹因子和其它。鉴定得到的2264个蛋白的转录本中,其中1077个转录本在毒腺组织中具有较高的表达。根据在毒腺组织中高表达、存在于毒液蛋白中和含有信号肽三个特征,在中红侧沟茧蜂毒液中共鉴定到75个蛋白。通过i TRAQ定量质谱检测了中红侧沟茧蜂寄生后棉铃虫血淋巴蛋白含量变化,共发现521个差异蛋白,其中10个来自中红侧沟茧蜂,包括钙网蛋白、小G蛋白和金属蛋白酶等。剩余的511个差异蛋白中,346个在寄生后的棉铃虫血淋巴中含量较高,165个在未被寄生的棉铃虫血淋巴中含量较高。按功能聚类,这些差异蛋白主要集中在免疫响应(immune response)、物质代谢(material metabolism)和胞外受体互作(extracellular matrix receptor interaction)等生理过程。糖代谢和脂质代谢的许多关键酶类在寄生后含量都显著的升高,如丙酮酸激酶和烯醇辅酶A水合酶等。综上,我们分析鉴定了中红侧沟茧蜂的毒液成分,并且发现寄生后棉铃虫血淋巴蛋白发生显著变化。2、中红侧沟茧蜂Rho1的功能研究利用i TRAQ定量质谱技术,在寄生后的棉铃虫血淋巴中检测来自中红侧沟茧蜂的小G蛋白,命名为Mm_Rho1。通过定量PCR分析,我们发现小G蛋白Mm_Rho1在中红侧沟茧蜂的毒腺和卵巢中有较高的表达。为了进一步研究其功能,我们对Mm_Rho1进行了体外重组表达,并且得到了纯度较高的重组蛋白。在干扰Mm_Rho1表达后,我们发现中红侧沟茧蜂的产卵量和成熟卵的数量显著减少,下一代的成茧率显著降低。然后检测了RNA干扰后卵黄蛋白原基因的表达,发现其表达量也显著下降。进一步检测Mm_Rho1对昆虫激素的影响,发现RNA干扰后,蜕皮激素的滴度升高,而保幼激素合成基因的表达显著下降,保幼激素分解代谢基因的表达则无变化,保幼激素的滴度下降。我们检测了Mm_Rho1对寄主昆虫棉铃虫细胞免疫的影响。通过体外注射Mm_Rho1重组蛋白,发现其可以显著地抑制棉铃虫细胞的延展、吞噬和包囊能力。进一步利用酵母双杂交和pull-down实验,证明Mm_Rho1可以与棉铃虫调控细胞骨架重排的Dia相互作用。综上,我们发现Mm_Rho1可以调控中红侧沟茧蜂的激素水平,影响卵的发育;同时Mm_Rho1通过与寄主Dia相互作用影响细胞骨架的重排,进而影响棉铃虫的细胞免疫。
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