近二十年,随着生物领域的发展,我们认识到核酸不仅仅是储存遗传信息的遗传物质,而且还可以被应用到基因分析,疾病诊断等领域。核酸的识别是依靠其互补链通过碱基互补配对来完成的,而自上世纪90年代适配子被发现并被广泛应用以来,核酸探针的检测范围就不只是局限在核酸的检测,而是拓展到了小分子,蛋白质,金属离子等诸多方面。为了进一步改进基于核酸探针的检测方法的灵敏度和兼容性,很多技术被引入到了相关策略中,包括纳米颗粒,酶促反应,信号放大技术等等。在本论文中,我们设计了一系列基于核酸探针的免标记方法用于检测核酸,酶及小分子。1.我们提出了一种通过使用氧化石墨烯(GO)和荧光分子Hoechst 33258实现免标记荧光策略用于检测DNA和酶。我们选择了一种常用的DNA染色剂Hoechst 33258。它是类平面结构的分子,可以被GO吸附且荧光能被淬灭,体系内的单链探针也同样会被GO所吸附。但当有目标序列存在,与单链探针形成双链时,该荧光分子可以结合双链随双链一起脱离GO表面,使体系荧光恢复。利用这种荧光的前后差异,我们实现了对目标DNA序列的检测,并将其拓展进行了其他几种酶的检测。2.DNA甲基化有很重要的生理学意义,它与很多生理现象息息相关,包括基因活化,基因印记,染色体稳定等。在这部分,我们利用一个简单可靠的荧光turn-off的策略对甲基转移酶Dam MTase进行了检测。在该方法中,我们设计了一个发卡结构的DNA探针,该探针含有Dam MTase识别位点,有可以形成银纳米簇的C序列端和能充当荧光增强子的G序列端。当发卡结构形成后,包含回文序列的双链区域即可作为甲基转移酶Dam MTase的作用底物,然后进一步被DpnI切割。随着酶切反应的进行,切割后的产物无法形成稳定的双链结构,发卡形DNA银纳米簇探针中富含C的序列端和富含G的序列端将从发卡结构上脱离下来。这个探针能对甲基转移酶进行特异性识别,并能通过荧光手段检测出酶含量,在没有引入任何信号放大手段的情况下,检测限为1U/mL。银纳米簇合成过程简单,方便,费用低；避免了DNA链与荧光基团的化学修饰过程,节约了时间和费用,相信这类手段在以后的生物检测中会有更多应用空间。3.作为有机生命体的能量作为有机生命体中无所不在的储能分子,三磷酸腺苷(ATP)很多生理过程中扮演了重要的角色,比如合成和降解生物分子,主动运输过程以及肌肉收缩等等。除此之外,ATP也可以反映出细胞存活,细胞损伤等多种细胞状态。在这部分工作中,我们设计了一个基于超支化滚环扩增的方法用于体外检测ATP,检测限达到了1nM,并且基于荧光原位杂交技术成功观察到了细胞内ATP的分布情况。