论文部分内容阅读
第一部分：北京地区呼吸道合胞病毒分离株F蛋白基因特征背景呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)属副粘病毒科肺炎病毒属，是引起儿童呼吸道感染最常见的病原微生物之一，几乎所有儿童2岁时都经历过1次或多次RSV感染。免疫缺陷者及老年人也是RSV易感人群。迄今为止该病毒感染的免疫和发病机制尚未完全阐明，对该病毒感染的防治亦无理想的措施。因此，开发特异的治疗方法或者有效的疫苗非常迫切。在RSV疫苗的开发中，F蛋白是具有潜力的亚单位候选疫苗，故对F蛋白基因特征的研究可为深入研究RSV的遗传特征和抗原变异提供理论基础，为疫苗株的选择提供参考依据。G蛋白是RSV结构蛋白中变异最显著的蛋白，目前对RSV的分子流行病学研究主要集中在G蛋白上，对F蛋白的研究很少。
方法:采用逆转录-聚合酶链反应(Reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)方法和ABI3100型序列分析仪，对2001，2004年从中国北京分离的有代表性的6株RSV病毒进行了F基因序列扩增和测定。然后用Sequencer，Bioedit和MEG3.0生物软件，将获得的6株RSV病毒F基因序列与GenBank中的RSV病毒F基因序列进行了同源性比较。
结果:在6株RSV病毒中，其中4株(beijing01-10、beijing04-9、beijing04-10、beijing04-13)为A亚型，2株(beijing04-11、beijing04-66)为B亚型。中国北京株A亚型之间F基因的核苷酸同源性在97％-97.4％之间，氨基酸同源性在92.1％-93％之间，与中国河北株(AY198175、AY198176、AY198177)的同源性最高，其核苷酸，氨基酸同源性分别达到96.6％-97.6％，90.3％-93.7％；2株北京B亚型分离株：BJ04-11与BJ04-66之间核苷酸同源性为97.3％、氨基酸同源性为98.2％。BJ04-11、BJ04-66与NC001781、AF013254的核苷酸同源性最高，分别为97.2％、97.6％；与NC001781、AF013254、AY353550氨基酸同源性最高，分别为98.7％，98.4％。A、B亚型之间，F基因的氨基酸在AA200～225，AA259～278区域是保守的。
结论:F基因具有划分基因型的能力，中国北京存在不同型别RSV病毒传播链引起的流行。研制针对北京乃至中国地区RSV的疫苗时可考虑选用AA200～225，AA259～278区域。
第二部分：F蛋白基因片段的原核表达和初步应用背景呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)是婴幼儿呼吸道感染的主要病原体。因此对病原学的诊断，治疗和预防就显得非常重要。从RSV被发现至今，人们一直在探索一种快速、敏感、特异的早期诊断方法。但病毒分离培养、病毒核酸RT-PCR检测、免疫荧光法、中和试验、补体结合试验这些方法并非尽如人意。而酶联免疫吸附实验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)的方法可以检测RSV感染患者血清中特异性抗体，具有较好的敏感性和特异性、其操作简便、成本低廉，易于在临床推广使用，因此发展RSV的血清学检测方法是建立临床实验室诊断的理想选择之一。另外对RSV感染至今缺乏特异性治疗方法，只有采用特异抗体进行被动免疫治疗，所以研究疫苗显得非常迫切，世界卫生组织(WHO)已将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展项目之一。F蛋白在RSV亚型之间高度保守，它既可诱导体液免疫，也可诱导细胞免疫，被认为是具有潜力的亚单位候选疫苗。该蛋白是由F1和F2亚单位通过二硫键连接构成，其主要的抗原表位集中于F1区(AA137～574)。
方法:从北京儿童医院患者鼻咽分泌物分离的呼吸道合胞病毒中，用RT-PCR的方法扩增出RSVF蛋白的F1区部分基因片段F1-1(AA137～363)，此区域包含F蛋白的主要中和抗原位点。将该基因片段克隆到pMD18-T载体，将连接质粒经PCR鉴定，证实插入目的片段。酶切后将该片段与pET-32a表达质粒连接，用限制性内切酶酶切及序列测定，证实插入片断的正确性。利用pET-32a表达质粒在大肠杆菌BL21表达正确的RSVF1-1蛋白。重组蛋白N端包含有6个连续的组氨酸标签，通过镍离子金属鏊合亲和层析纯化，获得了高纯度的目的重组蛋白RSVF1-1，然后将重组RSVF1-1包被建立间接ELISA法检测人血清中的RSVF蛋白IgG抗体。
结果:RT-PCR产物的片断大小为678bp。经酶切和测序鉴定后，插入序列无误。Westernblot分析显示：重组蛋白具有较好的抗原性。用该蛋白建立的间接ELISA方法检测结果与进口Euroimmun和维润试剂盒检测结果比较，差异无显著性。
结论:F蛋白基因片段的成功表达为进一步开发诊断试剂盒和中国RSV疫苗的研制提供了实验依据。