抗菌肽(Antimicrobialpeptide,AMP)是具有抗菌活性的一类短肽，其水溶性好，热稳定性高，能适应较大的pH变化或较高离子强度；AMP合成速度快，因分子小而易扩散，对正常真核细胞几乎没有损害；AMP除有广谱的抗菌活性外，还具有抗原虫、病毒及肿瘤细胞等广泛的生物活性。与传统抗生素不同的是，其杀细胞机制是在靶细胞膜上形成穿孔，细菌不易产生耐药性，因而最有希望成为“传统抗菌素”的替代品。AMP走向临床的一大挑战是如何低成本大量生产。虽然有许多关于AMP原核表达成功的报道，但这些方法仍然受制于纯化过程复杂、AMP酶降解及产出率低等问题而未能工业化。多角体蛋白(Polyhedrin，Polh)是昆虫杆状病毒的主要结构蛋白，在外界极其稳定，能保护病毒，且包涵体表达之重组多角体蛋白具有与天然蛋白质相同的特性。本研究的目的就是用来源于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的Polh作为融合伴侣，利用其稳定性及保护特性，建立一种新的低成本大量生产AMP的原核表达及纯化系统，促使AMP早日实现工业化生产，成为商品药物。 方法：构建pMPL102原核表达重组质粒，转化大肠杆菌后，经IPTG诱导，以包涵体形式表达重组融合蛋白Polh-GFP，对重组融合蛋白包涵体进行初步纯化，经昆虫肠道碱性蛋白酶或α-糜蛋白酶消化Polh，得到重组GFP产品。对产品进行SDS-PAGE及Western-blot分析。构建pTrcGFPuv原核表达重组质粒，仅表达GFP单体，与pMPL102进行对比表达，检测细菌生长密度，荧光密度及GFP表达量。构建重组原核表达载体pPAP，表达重组融合蛋白Polh-Hal18，对重组融合蛋白进行Ni-NTA金属离子亲和层析纯化，经羟胺剪切、透析、离心分离，回收抗菌肽Hal18并进行RP-HPLC纯化；对表达产物进行Tricine-PAGE、Western-blot分析，纯化后Hal18作质谱进行鉴定，并测定其抗菌活性。 结果：融合蛋白Polh-GFP(分子量约58kDa)以包涵体形式表达，表达量约占细菌总蛋白的30％，与表达单体可溶性GFP的菌株对比，表达Polh-GFP融合蛋白的菌株呈现较高的生长密度(约1.8倍)和GFP产出(约3.5倍)，且Polh-GFP融合蛋白显示出与天然多角体蛋白相似的特性，即快速溶于类似于昆虫中肠内的碱性pH条件。Polh能被小菜蛾中肠碱性蛋白酶或α-糜蛋白酶降解，融合蛋白中的GFP以及酶消化融合蛋白后得到的GFP仍然维持部分生物活性(发荧光)。融合蛋白Polh-Hal18(分子量约33.6kDa)也以包涵体形式表达。包涵体不仅提高了表达水平(Polh-Hal18表达水平可高达细菌总蛋白之50％)，且容易纯化；金属离子亲和层析纯化后得到纯度86％的产品，产品无抗菌活性；经过羟胺剪切，中性pH条件透析后离心(Polh不溶于该pH条件)，成功分离Polh与Hal18，所得到的Hal18(分子量约2kDa)粗制品纯度约25％，有抗菌活性；经RP-HPLC纯化后得到纯度＞90％的Hal18，最终回收率近30％。纯化之Hal18显示与化学合成之Hal18相同的抗G+代表株金黄色葡萄球菌及G-代表株大肠杆菌的抗菌活性。 结论：Polyheldrin是一个比较理想的融合伴侣，它能促进宿主菌生长，还能大大简化纯化步骤，提高蛋白回收率；Polyheldrin以包涵体的形式在E.coli中表达，但与其同时表达的GFP仍然维持部分生物活性(发荧光)。Polh作为融合伴侣能高水平表达出有抗菌活性之抗菌肽Hal18，且能避免融合蛋白被酶降解，还因纯化步骤简单而达到较高的产品回收率。大于抗菌肽分子10倍以上的融合伴侣Polh可以使融合蛋白获得高水平表达，此时融合蛋白中的抗菌肽因构像改变暂时失去生物活性。羟胺剪切经济、低毒且不影响抗菌肽活性，是不错的选择。本抗菌肽融合表达系统具有纯化过程简单、产品回收率高之特点，易于自动化及标准化，将极大地促进抗菌肽的功能研究，可用于产业化生产。 创新点：①首次应用Polyheldrin为融合伴侣表达GFP及AMP，利用多角体蛋白的稳定及保护特性，使融合蛋白以包涵体形式高水平表达于大肠杆菌；②利用多角体蛋白溶于碱性条件，不溶于中性or酸性条件之特性，简化纯化过程，大大提高了产品回收率。③用羟胺剪切融合蛋白，修饰的抗菌肽不影响其活性。④建立了可用于产业化生产的抗菌肽原核表达纯化系统。