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目的
探讨脊髓BDNF-mTOR通路在慢性束缚应激诱导痛觉过敏中的作用机制。
方法
1.16只雄性C57BL/6小鼠(2月龄，20～25g)，随机分成两组：对照组(Sham)、慢性束缚应激组(CRS)。慢性束缚应激模型于每天早上8:00开始，14:00结束，小鼠在应激期间禁饮食，连续束缚7天，分别于模型建立前1天、第3天、第5天、第7天和结束后第1天、第3天检测疼痛阈值。采用VonFrey丝和热水浴法检测小鼠机械缩爪阈值(Mechanical paw withdrawal threshold, PWMT)和甩尾潜伏期(Tail-flick latency, TFL)。行为学检测结束后断头取前扣带回皮层(Anterior cingulate cortex, ACC)、海马齿状回(Dentate gyrus, DG)和脊髓腰膨大。采用WesternBlot检测ACC、DG和脊髓中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、原肌球蛋白受体激酶B(Tropomyosin receptor kinase B，TrkB)、磷酸化原肌球蛋白受体激酶B(Phosphorylated tyrosine kinase B，p-TrkB)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylation of mammalian target of rapamycin，p-mTOR)含量。
2.48只雄性C57BL/6小鼠(2月龄，20～25g)，随机分为8组：溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，7,8-DHF对照组(DHF+Sham)，7,8-DHF应激组(DHF+CRS)，溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)，雷帕霉素应激组(Rapa+CRS)。所有药物于模型建立第7天行为学检测后腹腔内注射，给药后第1天和第3天检测PWMT和TFL，行为学检测结束后断头取脑组织和脊髓腰膨大备用。
3.48只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重180～200g，均在麻醉后鞘内留置导管，恢复4天后取置管成功的大鼠随机分为8组：溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，7,8-DHF对照组(DHF+Sham)，7,8-DHF应激组(DHF+CRS)，溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)，雷帕霉素应激组(Rapa+CRS)。所有药物于模型建立第7天行为学检测后鞘内注射，给药后第1天和第3天检测PWMT和TFL，行为学检测结束后断头取脑组织和脊髓腰膨大。采用WesternBlot方法检测脊髓组织中BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR和p-mTOR蛋白含量。
结果
1.建模后第3、5、7、8和10天PWMT和TFL显著降低(P<0.05)。在CRS小鼠中，ACC中BDNF水平显著降低(P<0.05)，p-mTOR水平显著升高(P<0.05)；而p-TrkB、TrkB和mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，暴露于CRS的小鼠脊髓中BDNF水平显著降低(P<0.05)，p-mTOR水平显著升高(P<0.05)；而p-TrkB、TrkB和mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和CRS组海马齿状回BDNF、p-TrkB、TrkB、p-mTOR和mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。
2.与溶剂对照组(Veh+Sham)相比，溶剂应激组(Veh+CRS)的PWMT和TFL明显降低(P<0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，腹腔内注射7,8-DHF(DHF+CRS)或雷帕霉素(Rapa+CRS)未改善小鼠慢性应激诱导的PWMT和TFL降低(P>0.05)。溶剂对照组(Veh+Sham)与7,8-DHF对照组(DHF+Sham)和雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)之间PWMT和TFL差异无统计学意义(P>0.05)。
3.与溶剂对照组(Veh+Sham)相比，溶剂应激组(Veh+CRS)的PWMT和TFL明显降低(P<0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，鞘内注射7,8-DHF(DHF+CRS)明显改善慢性应激诱导的PWMT和TFL降低(P<0.05)。而溶剂对照组(Veh+Sham)与7,8-DHF对照组(DHF+Sham)之间PWMT和TFL差异无统计学意义(P>0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，7,8-DHF应激组(DHF+CRS)脊髓中p-TrkB蛋白含量明显增加(P<0.05)，p-mTOR蛋白含量明显减少(P<0.05)；相反，BDNF、TrkB、mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。溶剂对照组(Veh+Sham)与7,8-DHF对照组(DHF+Sham)中BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR和p-mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。
与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，鞘内注射雷帕霉素(Rapa+CRS)能明显改善慢性应激诱导的PWMT和TFL降低(P<0.05)。而溶剂对照组(Veh+Sham)与雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)之间PWMT和TFL差异无统计学意义(P>0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，雷帕霉素应激组(Rapa+CRS)脊髓中p-mTOR蛋白含量明显减少(P<0.05)；而BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。此外，溶剂对照组(Veh+Sham)与雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)中BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR和p-mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。
结论
1.慢性应激引起的痛觉过敏与脊髓中的BDNF-mTOR信号通路异常密切相关；
2.鞘内注射7,8-DHF或雷帕霉素可能为CRS引起的痛觉过敏提供有效的治疗方法。
探讨脊髓BDNF-mTOR通路在慢性束缚应激诱导痛觉过敏中的作用机制。
方法
1.16只雄性C57BL/6小鼠(2月龄，20～25g)，随机分成两组：对照组(Sham)、慢性束缚应激组(CRS)。慢性束缚应激模型于每天早上8:00开始，14:00结束，小鼠在应激期间禁饮食，连续束缚7天，分别于模型建立前1天、第3天、第5天、第7天和结束后第1天、第3天检测疼痛阈值。采用VonFrey丝和热水浴法检测小鼠机械缩爪阈值(Mechanical paw withdrawal threshold, PWMT)和甩尾潜伏期(Tail-flick latency, TFL)。行为学检测结束后断头取前扣带回皮层(Anterior cingulate cortex, ACC)、海马齿状回(Dentate gyrus, DG)和脊髓腰膨大。采用WesternBlot检测ACC、DG和脊髓中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、原肌球蛋白受体激酶B(Tropomyosin receptor kinase B，TrkB)、磷酸化原肌球蛋白受体激酶B(Phosphorylated tyrosine kinase B，p-TrkB)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylation of mammalian target of rapamycin，p-mTOR)含量。
2.48只雄性C57BL/6小鼠(2月龄，20～25g)，随机分为8组：溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，7,8-DHF对照组(DHF+Sham)，7,8-DHF应激组(DHF+CRS)，溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)，雷帕霉素应激组(Rapa+CRS)。所有药物于模型建立第7天行为学检测后腹腔内注射，给药后第1天和第3天检测PWMT和TFL，行为学检测结束后断头取脑组织和脊髓腰膨大备用。
3.48只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重180～200g，均在麻醉后鞘内留置导管，恢复4天后取置管成功的大鼠随机分为8组：溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，7,8-DHF对照组(DHF+Sham)，7,8-DHF应激组(DHF+CRS)，溶剂对照组(Veh+Sham)，溶剂应激组(Veh+CRS)，雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)，雷帕霉素应激组(Rapa+CRS)。所有药物于模型建立第7天行为学检测后鞘内注射，给药后第1天和第3天检测PWMT和TFL，行为学检测结束后断头取脑组织和脊髓腰膨大。采用WesternBlot方法检测脊髓组织中BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR和p-mTOR蛋白含量。
结果
1.建模后第3、5、7、8和10天PWMT和TFL显著降低(P<0.05)。在CRS小鼠中，ACC中BDNF水平显著降低(P<0.05)，p-mTOR水平显著升高(P<0.05)；而p-TrkB、TrkB和mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，暴露于CRS的小鼠脊髓中BDNF水平显著降低(P<0.05)，p-mTOR水平显著升高(P<0.05)；而p-TrkB、TrkB和mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和CRS组海马齿状回BDNF、p-TrkB、TrkB、p-mTOR和mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。
2.与溶剂对照组(Veh+Sham)相比，溶剂应激组(Veh+CRS)的PWMT和TFL明显降低(P<0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，腹腔内注射7,8-DHF(DHF+CRS)或雷帕霉素(Rapa+CRS)未改善小鼠慢性应激诱导的PWMT和TFL降低(P>0.05)。溶剂对照组(Veh+Sham)与7,8-DHF对照组(DHF+Sham)和雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)之间PWMT和TFL差异无统计学意义(P>0.05)。
3.与溶剂对照组(Veh+Sham)相比，溶剂应激组(Veh+CRS)的PWMT和TFL明显降低(P<0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，鞘内注射7,8-DHF(DHF+CRS)明显改善慢性应激诱导的PWMT和TFL降低(P<0.05)。而溶剂对照组(Veh+Sham)与7,8-DHF对照组(DHF+Sham)之间PWMT和TFL差异无统计学意义(P>0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，7,8-DHF应激组(DHF+CRS)脊髓中p-TrkB蛋白含量明显增加(P<0.05)，p-mTOR蛋白含量明显减少(P<0.05)；相反，BDNF、TrkB、mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。溶剂对照组(Veh+Sham)与7,8-DHF对照组(DHF+Sham)中BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR和p-mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。
与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，鞘内注射雷帕霉素(Rapa+CRS)能明显改善慢性应激诱导的PWMT和TFL降低(P<0.05)。而溶剂对照组(Veh+Sham)与雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)之间PWMT和TFL差异无统计学意义(P>0.05)。与溶剂应激组(Veh+CRS)相比，雷帕霉素应激组(Rapa+CRS)脊髓中p-mTOR蛋白含量明显减少(P<0.05)；而BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。此外，溶剂对照组(Veh+Sham)与雷帕霉素对照组(Rapa+Sham)中BDNF、TrkB、p-TrkB、mTOR和p-mTOR蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。
结论
1.慢性应激引起的痛觉过敏与脊髓中的BDNF-mTOR信号通路异常密切相关；
2.鞘内注射7,8-DHF或雷帕霉素可能为CRS引起的痛觉过敏提供有效的治疗方法。