烟曲霉(Aspergillus fumigatus,Af)是一种机会致病菌,归类于曲霉属,广泛存在于自然界,其孢子直径为2~3微米,因为在空气中悬浮时间长而易于人体吸入。正常人吸入孢子后,肺部免疫系统可将其清除,部分人则会发生曲霉引起的哮喘、变应性支气管肺曲霉菌病、过敏性曲霉鼻窦炎、以及过敏性肺炎等曲菌病;但如果免疫抑制患者吸入烟曲霉,则可引起侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)。近年来此种疾病患病率逐步攀升、致死率可高达50%~95%,而目前临床却面临着抗真菌药物副作用大、治疗效果不理想的形势。因此从多方面探讨烟曲霉感染的致病机理,寻找新的治疗靶点,进一步制定更加有效的治疗方法成为目前亟待解决的重要问题。由于烟曲霉是机会致病菌,主要感染免疫抑制患者,因此机体的免疫反应在烟曲霉感染中尤为重要。固有免疫是机体抵御烟曲霉侵袭的第一道防线,例如肺泡巨噬细胞对孢子的吞噬,特异性真菌肽与树突状细胞模式识别受体结合,树突状细胞活化,释放细胞因子和趋化因子趋化中性粒细胞和炎性细胞,以及中性粒细胞介导NADPH氧化酶诱导的损伤等。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是免疫调控的关键细胞之一,是作为固有免疫与适应性免疫的桥梁。它不仅可以识别烟曲霉的孢子及菌丝,产生多种细胞因子及趋化因子,募集吞噬细胞,并且还能诱导T淋巴细胞分化成Th1、Th2等不同的效应细胞,因此它在抵御真菌的感染中扮演着不可或缺的角色。抗原递呈细胞将烟曲霉抗原递呈给CD4+T细胞,引发适应性免疫反应,所以,Th细胞在烟曲霉感染性疾病中发挥着关键的作用。Th1细胞主要分泌促炎因子IFN-γ,诱导保护性抗真菌防御反应,Th2细胞释放IL-4和IL-10激活体液免疫,而Th17细胞则主要分泌IL-17促进中性粒细胞的募集,促进对烟曲霉菌丝的清除。Micro RNA(mi RNA)是细胞内长度为l8~25个碱基的寡聚核苷酸,作用于基因转录后水平,通过与靶基因m RNA的3’端非编码区结合,达到抑制靶基因的翻译以及降解其m RNA的目的。micro RNA在免疫细胞的分化发育、免疫应答的调控以及肿瘤的发生发展等过程中发挥重要的作用,近几年来研究发现在HIV-1感染,EB病毒感染,以及在结核病中与幽门螺旋杆菌感染等感染性疾病中,micro RNA表达谱都存在异常表达的情况;CD4+T细胞中,mi R-17和mi R-19b可促进Th1的生成,并抑制调节性T细胞分化;mi R-146不仅参与了Toll样受体信号传导的反馈性负相调控,还可通过作用于TRAF6/IRAK1/IRAK2而负相调控RIG-I通路的I型干扰素的产生;mi R-21则可通过抑制T淋巴细胞产生IFN-γ来降低IL-4水平。可见micro RNA对T辅助细胞的形成以及细胞因子的分泌发挥重要作用。mi RNA的相关功能虽然在其它许多疾病中都有研究,在烟曲霉感染中的作用却少有报道。我们的前期研究显示,在诸多人类慢性炎症性疾病反应中,存在树突状细胞与巨噬细胞等抗原递呈细胞大量募集,并引发了Th1,Th2,Th17等T细胞的反应。由此,我们推测,烟曲霉感染患者其micro RNA可通过直接或间接作用于CD4+T细胞内相关蛋白质,最终调节机体针对烟曲霉感染的适应性免疫反应。本研究将首次在人烟曲霉抗原活化的CD4+T细胞中筛选出烟曲霉相关的Micro RNA表达谱,并对差异表达的Micro RNA进行验证,通过生物信息学分析预测其靶点,最后分析差异表达的Micro RNA对烟曲霉抗原活化的CD4+T细胞分泌细胞因子具有调节作用。我们的研究或可为烟曲霉感染性疾病的治疗提供一种新的思路。第一部分树突状细胞递呈的烟曲霉抗原对CD4+T细胞的活化作用及功能影响目的:研究递呈烟曲霉抗原的树突状细胞对Th细胞的诱导活化作用。方法:采用烟曲霉菌制备烟曲霉提取物(Aspergillus fumigatus extract,AFE),将其负载于树突状细胞上;外周血中分离出CD4+T细胞,并与负载了烟曲霉抗原的树突状细胞共培养,树突状细胞与CD4+T细胞比例为1:5。共培养24h后应用流式细胞术检测T细胞表面活化标记CD69的表达情况,以及胞内细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17与IL-22的分泌水平,并采用CCK8试剂盒分析其对T细胞增殖的影响。结果:负载烟曲霉抗原的DC细胞与CD4+T细胞共培养24h后CD4+T细胞增殖明显,且CD69的表达明显上调;相比其它细胞因子,烟曲霉抗原活化CD4+T细胞48h后IFN-γ与IL-22分泌水平明显升高。小结:以上表明,烟曲霉提取物负载的树突状细胞可以有效的活化人CD4+T细胞,并可引起T细胞的增殖及细胞因子的分泌等一系列保护性真菌防御反应,这为后续芯片的筛选及研究打下了基础。第二部分烟曲霉活化的CD4+T细胞中异常表达micro RNA的检测及验证目的:筛选出烟曲霉活化的CD4+T细胞中异常表达micro RNA。方法:将负载烟曲霉抗原的树突状细胞与CD4+T细胞共培养24h,磁珠分选CD4+T细胞后抽提细胞总m RNA,用cyanine 3(Cy3)-PCP标记后杂交到micro RNA序列模片上进行扫描;随机挑选芯片结果中6个micro RNAs,使用Real-time PCR法对芯片结果进行验证。结果:芯片扫描结果显示,使用烟曲霉提取物活化CD4+T细胞组与未使用烟曲霉活化的CD4+T细胞组相比,共有54个异常表达的micro RNAs,其中26个表达上调,28个表达下调。我们选择其中异常表达的6个micro RNAs:mi RNA-142-3P,miRNA-630,mi RNA-130b-3P,mi RNA-652-3P,mi RNA-494,mi RN-A-574-5P进行了R eal-time PCR的验证。验证结果与芯片一致。小结:芯片扫描及Real-time PCR结果均表明,烟曲霉提取物活化的CD4+T细胞中存在着异常表达的micro RNA。第三部分目的micro RNA的筛选及其靶基因预测与功能分析目的:初步筛选出异常表达micro RNA中目的micro RNA并分析其参与调控的生物学功能及信号通路。方法:将差异表达的micro RNA综合荧光值以及差异倍数进行降序排列,选出感兴趣的目的micro RNA,利用TARGETMINER,mi RDB,micro RNA,Tar Base,RNA22五个数据库预测目的micro RNA的靶基因,将预测的靶基因进行GO和Pathway分析。结果:筛选出的目的micro RNA为mi RNA-142-3P,GO分析显示,mi RNA-142-3P的靶基因参与调控的显著功能主要为蛋白质结合,细胞粘附,信号转导,调控细胞进程,调控代谢等。Pathway分析得到差异表达的micro RNA较显著性的信号通路主要为细胞的吞噬,MAPK等。小结:以上分析结果显示,筛选出的差异表达的mi RNA-142-3P,其靶基因参与许多生物学功能与代谢通路的调控,而这些生物学功能以及信号通路已经研究证实在T细胞的活化,增殖以及分化等过程中发挥着重要作用。第四部分烟曲霉活化的CD4+T细胞中mi RNA-142-3P对细胞因子分泌的影响及机制探讨目的:探讨mi RNA-142-3P在CD4+T细胞中调控细胞因子分泌的可能机制方法:将mi RNA-142-3P的模拟体与抑制体转染进入CD4+T细胞后,使用烟曲霉提取物进行刺激。检测IFN-γ与IL-22的分泌情况,继而检测RICTOR的蛋白表达水平,以及下游AKT的磷酸化情况;使用RNA干扰技术将CD4+T中的RICTOR进行基因沉默,分别检测RICTOR的m RNA和蛋白质表达水平,以及AKT的磷酸化情况,并对细胞因子的分泌变化情况进行检测分析。结果:将mi RNA-142-3P的模拟体转染入CD4+T细胞后,RICTOR表达降低,AKT磷酸化水平及IFN-γ表达水平均明显降低,而IL-22的表达没有明显的变化;与此相反,将mi RNA-142-3P抑制体转染入CD4+T细胞后,RICTOR表达升高,AKT磷酸化水平及IFN-γ表达水平升高,IL-22表达水平没有显著变化;使用RNA干扰技术干扰RICTOR的表达后发现,AKT磷酸化水平降低,并且IFN-γ的分泌水平降低。小结:以上结果表明,在烟曲霉提取物活化的CD4+T细胞中mi RNA-142-3P下调,其可以通过上调RICTOR的表达,引起AKT的磷酸化水平增加,IFN-γ的分泌增多,进而可以增强机体对抗真菌的防御性反应。结论1.树突状细胞递呈的烟曲霉提取物可有效的刺激CD4+T细胞活化,并诱发保护性抗真菌防御反应。2.在烟曲霉提取物活化的CD4+T细胞中,micro RNA表达谱存在异常,提示或许在烟曲霉感染性疾病中,micro RNA的差异表达可能是调节其免疫反应的机制之一。3.在烟曲霉提取物活化CD4+T细胞中,T细胞活化所导致的mi RNA-142-3P下调可明显上调RICTOR的表达,最终通过增强IFN-γ的分泌来起到对抗烟曲霉感染的目的。