钝鳞紫背苔中肉桂醇脱氢酶的基因克隆和功能鉴定

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苔藓植物是从水生向陆生过渡的重要类群,含有萜类、联苄、黄酮、木脂素和木质素等多种多样的次级代谢产物,具有广泛的生物活性。此外,这些次级代谢产物在苔藓植物适应陆地环境中起了重要作用。其中木质素能够维持植物正常结构、输导水分和养料、防御不良外界环境侵袭。由于缺少基因信息,苔藓植物木质素生物合成途径中的很多重要关键酶基因尚未被克隆和鉴定。肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)是木质素单体生物合成中的关键酶,催化最后一步还原反应,将五种羟基化、甲基化程度不同的醛还原成为对应的醇。CAD基因是一个多基因家族,根据系统进化分析和基因结构功能的差异可以将大部分CAD基因分为三类。 本文从钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)的cDNA文库中得到两个注释为肉桂醇脱氢酶基因的序列,分别命名为PaCAD1和PaCAD2。将它们构建到原核表达载体上并且转入表达型大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达,表达出的蛋白纯化后进行体外酶活鉴定。并合成了酶反应所需底物和产物标准品。酶反应结果显示PaCAD1和PaCAD2对五种底物对羟基肉桂醛(p-coumaryl aldehyde)、咖啡醛(caffeyl aldehyde)、松柏醛(coniferyl aldehyde)、5-羟基松柏醛(5-hydroxyconiferyl aldehyde)和芥子醛(sinapyl aldehyde)均有催化活性。酶学动力学分析结果表明PaCAD1和PaCAD2的最适底物分别为咖啡醛和松柏醛,两酶对对羟基肉桂醛也有较强催化活性,对5-羟基松柏醛和芥子醛催化活性较低。进化分析结果显示,PaCAD1和PaCAD2属于第Ⅱ类肉桂醇脱氢酶。经过序列比对,发现第Ⅱ类中部分已验证过功能的基因同PaCAD1和PaCAD2且有保守结构域VTG(X)2G(X)9L(X)5。同时,测定了钝鳞紫背苔的叶状体和愈伤组织中的木质素含量,结果显示叶状体中的含量明显高于愈伤组织,这与PaCAD2在叶片中的表达显著高于愈伤组织中的结果一致。PaCAD1和PaCAD2的表达还受到外源茉莉酸甲酯(Methyl jasmonic acid,MeJA)诱导,说明两酶参与应对生存逆境,再次证明两酶在木质素生物合成途径中起重要作用。这是第一次研究非维管植物中的肉桂醇脱氢酶,本研究为通过代谢工程手段提高木质素含量提供了两个候选基因,同时有助于理解木质素的起源和进化。
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