Caveolin-1减轻非酒精性脂肪肝状态下对乙酰氨基酚引起的血管氧化应激和炎症

来源 :安徽医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhijie882008
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背景:对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是世界上应用最为广泛的药物之一。过量或者长期使用APAP可导致心血管功能障碍加重。在脂肪肝疾病中使用APAP引起的血管紧张素Ⅱ(angiotensin II,Ang II)急性升高可能会增加血管损伤的风险和严重程度。然而,其潜在机制尚不清楚。小窝蛋白1(caveolin-1,CAV1)是一种广谱激酶抑制剂,在维持血管内皮功能稳定的过程中发挥重要作用。目的:本研究旨在探讨CAV1是否可以通过靶向AngⅡ或其下游途径缓解非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)状态下APAP引起的血管氧化应激和炎症。方法:采用7周大的C57BL/6雄性小鼠(18-20 g),随机分成12组:(1)正常组(N),(2)高脂饮食组(HFD),(3)对乙酰氨基酚组(APAP),(4)高脂饮食+对乙酰氨基酚组(HFD+APAP),(5)正常+腺病毒对照组(N+AAV-Control),(6)高脂饮食+腺病毒对照组(HFD+AAV-Control),(7)对乙酰氨基酚+腺病毒对照组(APAP+AAV-Control),(8)高脂饮食+对乙酰氨基酚+腺病毒对照组(HFD+APAP+AAV-Control),(9)正常+腺病毒组(N+AAV-CAV1),(10)高脂饮食+腺病毒组(HFD+AAV-CAV1),(11)对乙酰氨基酚+腺病毒组(APAP+AAV-CAV1),(12)高脂饮食+对乙酰氨基酚+腺病毒组(HFD+APAP+AAV-CAV1)。在非酒精性脂肪肝造模完成前的24h,用APAP 300mg/kg灌胃给药,然后禁食。24h后将小鼠处死并尽快收集血清和肝脏和血管组织。H&E染色检测肝脏和血管组织的病理学改变;SEM观察胸主动脉内皮的状态;试剂盒检测血清中ALT、AST、GSH、MDA、TG水平;ELISA检测炎症因子TNFα、IL-1β、IL-6和AngⅡ;免疫组化染色观察肝脏和血管3-NT和Vcam-1指标。Western blotting检测CAV1、ACE2、Ang II、3-NT、Vcam-1、TNFα、IL-1β、IL-6、PKC、MAPK蛋白的表达。体外使用AngⅡ(300n M)培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)48h建立血管内皮损伤模型,借助Western blot、RT-q PCR、流式实验检测细胞模型炎症和氧化应激指标。分别采用CAV1过表达质粒、小干扰RNA以及PKC抑制剂处理AngⅡ刺激后的HUVEC细胞来研究CAV1是否通过PKC/MAPK通路发挥保护作用。免疫荧光进一步检测了细胞内PKC的定位以及含量。结果:动物实验中,试剂盒检测结果显示HFD组的ALT、AST、TG含量高于N组。此外,HFD+APAP组的这些参数明显高于APAP组。WB结果显示在HFD+APAP组中,脂质合成相关蛋白SREBP-1c表达增加,而脂肪氧化相关蛋白PPARα表达减少。与这些结果一致,HFD+APAP组小鼠肝脏组织中出现严重的脂质沉积、炎症细胞浸润和肝内坏死增加。胸主动脉切片和ELISA显示与APAP组相比,HFD+APAP组胸主动脉内膜厚度和血清Ang II含量增加。WB结果显示在HFD+APAP组小鼠血管组织中Ang II表达增加,而CAV1表达降低。扫描电镜结果显示,N组和APAP组血管内皮的完整性更好。与N组相比,HFD组血管内皮表面更加粗糙。HFD+APAP组小鼠血管内皮连接松动,出现多个损伤孔。对血管组织氧化应激相关指标进行检测发现与N组比较,HFD和APAP组GSH和SOD活性降低,MDA水平升高;与APAP组相比,HFD+APAP组GSH、SOD活性进一步降低,MDA水平明显升高。胸主动脉免疫组化分析显示,3-NT在HFD和APAP组中表达增加,HFD+APAP组中3-NT表达增加最多。同时,我们还观察到HFD+APAP组肝组织内血管和窦内皮中3-NT水平升高。ELISA结果显示,HFD和APAP组炎症因子水平升高,HFD+APAP组炎症因子水平高于APAP组,与这些结果一致的是HFD+APAP组小鼠胸主动脉组织中炎症因子相关蛋白表达水平升高。免疫组化结果显示HFD+APAP小鼠胸主动脉、肝组织血管、肝窦内皮中vcam-1表达增加。与HFD+APAP+Control组相比,注射AAV-CAV1后小鼠的肝损伤指标和脂质积聚程度明显减轻。血管的内膜厚度、氧化应激、炎症指标显著降低。以上结果提示CAV1能降低APAP引起的小鼠肝脂肪变性和血管内皮氧化应激以及炎症。此外,WB结果显示,CAV1抑制了APAP+HFD组中PKC与MAPK的磷酸化水平。上述结果提示CAV1可能通过抑制PKC/MAPK通路来缓解非酒精性脂肪肝状态下对乙酰氨基酚引起的血管内皮炎症和氧化应激。体外实验中,采用AngⅡ(300n M)孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。48h后WB、PCR检测结果显示CAV1表达量降低,炎症因子表达水平增加,流式结果显示氧化应激水平增加。免疫荧光结果显示PKC表达增加而且较多的聚集在线粒体的位置,随后我们通过流式检测后发现线粒体膜电位降低。与阴性对照组相比,过表达小窝蛋白后CAV1表达增加的同时炎症因子表达水平降低,氧化应激也有所缓解。同时,免疫荧光显示PKC表达水平降低。而沉默CAV1后出现了相反的结果。上述结果进一步提示CAV1可能通过抑制PKC通路起到保护作用。为了进一步确定CAV1是否通过PKC通路发挥调控作用我们还使用了PKC抑制剂。HUVECs经PKC抑制剂处理后,CAV1蛋白表达无明显变化,但在AngⅡ+PKC412和AngⅡ+PKC412+CAV1-sirna组中,PKC和p-P38蛋白水平下降。免疫荧光结果也显示使用PKC412后,线粒体中PKC的荧光水平降低,线粒体膜电位恢复。同时,在HUVECs中Ang II或Ang II+CAV1-si RNA诱导的氧化应激和炎症也被PKC412抑制。结论:(1)非酒精性脂肪肝状态下使用APAP可能会增加血管氧化应激和炎症;(2)CAV1对非酒精性脂肪肝状态下APAP所致的血管损伤具有保护作用并可能与其抑制PKC/MAPK通路有关。
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