背景：丝状真菌是一类重要的微生物,具有丰富的次级代谢谱,其中不乏一些重要的活性物质,包括抗生素、抗癌物质、降胆固醇类物质以及免疫抑制剂等,可见丝状真菌是重要的天然产物宝库,对其次级代谢及生长发育即全局性调控的研究是十分重要且有必要的。但是对真菌的次级代谢及生长发育的调控较原核生物更复杂,近些年的研究表明真菌的次级代谢除了受途径特异性调控因子的调控外还受到全局性调控因子的全局调控,具有复杂的层级网络调控关系。2004年在构巢曲霉中分离鉴定了一种全局性调控因子LaeA,其普遍存在于丝状真菌中,调控次级代谢生物合成的同时影响多项生长发育相关的途径。LaeA作为丝状真菌中十分重要的的全局性调控因子,是近些年丝状真菌中的研究热点,并有了许多重要的进展,2008年在构巢曲霉中发现了LaeA/VeA/VelB蛋白三聚体所调控的全局性调控网络,至此LaeA的研究进入一个新的层面,研究方向也更多地集中在全局网络的确定以及调控机制的阐明方面。橘青霉是一类重要的降胆固醇类药物美伐他汀的产生菌,除此之外作为重要的丝状真菌,还具有产生许多其他生物活性物质的潜力,但是到目前为止关于其生长发育和次级代谢调控的研究还较少,所以对橘青霉内调控网络的研究具有十分重要的基础科学意义和社会应用价值。本实验室已经就橘青霉展开了一些基础工作,包括菌株培养、遗传转化体系的构建以及全局性调控因子LaeA的克隆等。LaeA作为丝状真菌中典型的全局性调控因子,已证明在丝状真菌调控网络中扮演着重要的角色。以LaeA作为出发点去研究橘青霉中次级代谢产物生物合成的调控网络具有较好的研究基础。生物合成调控网络伴随着许多关键蛋白间的相互作用,因此对橘青霉中的LaeA蛋白相互作用研究有助于阐明LaeA在橘青霉中的网络调控机制,有利于挖掘相关蛋白拓展橘青霉次级代谢产物生物合成的调控网络,从而达到提高美伐他汀产量和产生新的天然活性化合物的最终目的。目的：本文旨在通过体外探究橘青霉中LaeA与VeA的相互作用以及体内串联亲和与LaeA相互作用蛋白来初步推测LaeA的全局调控网络,为接下来的调控机制研究奠定基础。方法：1.将LaeA与VeA串联在PET-Duet-1原核表达载体上在BL21型大肠杆菌中异源共表达,利用镍亲和纯化的方法纯化出带有His标签的VeA蛋白,同时SDS-PAGE检测是否存在由于与VeA的结合而被纯化出来的LaeA以此来体外验证LaeA与VeA是否具有相互作用。2.构建功能域S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合域缺失型LaeA基因即LaeA (ΔSAM),利用方法1中的异源共表达方法探究SAM Domain在LaeA蛋白相互作用中所扮演的角色。3.过表达LaeA (ΔSAM)后研究SAM Domain对LaeA的全局调控功能的影响：利用HPLC检测美伐他汀产量；血细胞计数板计算孢子的产量。4.构建LaeA串联亲和载体PGiHTGi-TAP-LaeA,通过农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系转入橘青霉中并利用镍亲和和链霉亲和素两步纯化筛选与LaeA相互作用的蛋白,然后通过MALDI-TOF生物质谱鉴定蛋白,最后通过对鉴定的蛋白生物信息学分析初步推测橘青霉中LaeA的全局性调控网络。结果：1. LaeA与VeA共表达后,经镍亲和纯化后SDS-PAGE考染结果显示LaeA与VeA同时被纯化出来,证实LaeA与VeA体外具有相互作用。2.利用重叠PCR的方法成功获得SAM Domain缺失型LaeA基因即LaeA (ΔSAM),将LaeA (ΔSAM)与VeA共表达后,经镍亲和纯化仅有VeA被纯化出来,证实LaeA在缺失SAM Domain后失去了与VeA结合的能力。3.利用农杆菌介导的橘青霉转化方法得到LaeA (ΔSAM)过表达型橘青霉即OE::LaeA(ΔSAM)菌株,发酵七天后HPLC检测其美伐他汀的产量相对于OE::LaeA有很明显的降低,更接近WT; OE::LaeA (ΔSAM)的孢子产量比WT低31%,而OE::LaeA的孢子产量则仅比WT低9.9%。4.成功构建LaeA串联亲和表达载体PGiHTGi-SBP-LaeA-His,利用农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系转入橘青霉中,经链霉亲和素结合肽和镍亲和两步纯化后经SDS-PAGE检测得到与LaeA相互作用蛋白。5.将4中串联亲和得到的蛋白进行胶内酶解后MALDI-TOF质谱鉴定蛋白,成功鉴定到5个与LaeA相互作用蛋白,结合文献资料以及生物信息学分析推测其中3种蛋白与LaeA全局调控有关：Protein sey-1是一种GTP-binding protein可能与橘青霉内G蛋白信号通路的调控有关；DST1-like protein是一种锌指类转录调控因子,涉及到生物合成基因簇的转录；Cystathionine-β-synthase (CBS)是胱硫醚-p-合成酶,其含有典型的CBS domain,可以与许多蛋白结构结合从而使该蛋白对带有腺苷结构的配体敏感,同时其具有SAM结合位点,推测可能与LaeA的组蛋白甲基转移修饰相关。结论：橘青霉中的LaeA与VeA在体外具有相互作用,且LaeA的SAM Domain是其与VeA蛋白相互作用中不可或缺的结构域；SAM Domain是LaeA调控美伐他汀合成和孢子产量的重要功能域；推测LaeA可能受到G蛋白Seyl相关的信号通路的影响,并通过与锌指类转录因子DSTl-like Protein结合来调控次级代谢,另外LaeA还可能通过与CBS结合从而刺激SAM结合能力从而影响LaeA的组蛋白甲基转移修饰。这些结果有助于深入理解橘青霉中LaeA调控网络,为接下来的遗传改造奠定基础。