1目的从临床研究和体外细胞实验的角度探讨类风湿关节炎(RA)患者凝血纤溶指标、致炎/抑炎细胞因子、血瘀状态、NF-κB信号通路、miR-155、生活质量及实验室指标变化,研究新风胶囊(Xinfeng Capsule,XFC)对RA的影响,探讨XFC调节RA血瘀状态的作用机制。2方法2.1理论研究通过中国知网数据库、万方数据库大量文献检索研究,分析RA患者血瘀证与中医脾虚之间的关系,总结其中医学病因病机及临床疗效,阐述RA血瘀证从脾论治的理论依据。2.2临床研究选取2014年1月-2014年12月来自安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院病人的60例RA患者。运用随机数字表法将其分组为XFC组30例和来氟米特(LEF)组30例,另设20例健康对照组来自本医院健康体检中心。采用ELISA检测RA患者血清中白细胞介素10(IL-10)、IL-6、IL-4、IL-17、NF-κB激活因子1(Act1)、p50、p65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、血小板激活因子(PAF)、血小板激活因子-乙酰水解酶(PAF-AH)、血栓素B2(TXB2)、6-酮前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体水平,全自动血细胞分析仪检测血小板(PLT),魏氏法检测血沉(ESR),全自动生化仪检测C反应蛋白(CRP),类风湿因子(RF),全自动凝血仪检测D-二聚体(D-D)、纤维蛋白原(FBG)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(APTT)水平;同时半定量反转录PCR检测Act1、p65、p50、IκBα、IκB激酶α(IKKα),荧光定量PCR检测外周血Act1m RNA、p65m RNA、p50m RNA、miR-155;Western blot法检测NF-κB激活剂1(Act1)、p65、p50、IκBα蛋白表达水平;采用问卷量表观察RA患者生活质量;观察XFC对RA患者的疗效、凝血纤溶指标、NF-κB信号通路等的影响。2.3体外实验研究从所选的60例RA患者中选取15例RA患者,收集15例RA患者外周血10ml,加入适量淋巴细胞分离液,放入高速柱状离心机20℃3000R/min离心15分钟,分离出PBMC,然后加入含血清的1640完全培养液培养,加入LPS刺激24h,然后加入转染试剂及miR-155 mimic或miR-155 mimic cntrol、XFC培养,然后提取RNA用于荧光定量PCR检测miR-155表达;同时收集细胞上清,ELISA检测IL-17和IL-6的表达水平。3结果3.1理论研究结果脾虚与血瘀之间存在着密切的联系,如脾虚生化乏源气血生成不足,则气虚血少,血行无力而致瘀;脾虚不能运化津液,使脉道涩滞不通而成瘀;脾气虚损,则统摄无权、血不循经而溢出脉外即成瘀血;脾阳气虚衰,血液失于温煦而凝聚成瘀。RA患者的关节重着、肿胀、疼痛、麻木、屈伸不利,关节周围结节,皮下瘀斑等均与血瘀有着密不可分的关系,是中医血瘀证本质的重要表现,血瘀证贯穿于RA病程始终,而RA日久不愈,病情反复缠绵,则会损害脏腑,使脾脏虚损,从而加重血瘀,故脾虚是RA血瘀证产生的重要因素,所以对于RA血瘀证的治疗,从脾论治、顾护脾胃相当重要。3.2临床研究结果3.2.1 RA患者外周血中凝血纤溶指标的变化检测60例RA患者及20例正常健康人外周血凝血纤溶指标,与正常组相比,60例RA患者外周血D-D、FBG、PLT明显升高(P<0.05),异常例数分别为51、34、24,分别占85%、56.67%、40%;TT、APTT、PT无明显改变(P>0.05),但其仍有异常,异常例数分别为2、8、4,占3.33%、13.33%、6.67%。3.2.2 RA患者外周血促凝/抗凝因子的变化检测60例RA患者及20例正常健康人外周血的促凝/抗凝因子,与正常对照组比较,RA患者而外周血PAF、TXB2明显升高(P<0.05),PAF-AH、6-keto-PGF1a明显下降(P<0.05)。3.2.3 RA患者外周血致炎/抑炎细胞因子的变化检测60例RA患者及20例正常健康人外周血的致炎/抑炎细胞因子,发现RA患者外周血IL-17、IL-6相比与正常人则明显升高(P<0.05),IL-10、IL-4则明显降低(P<0.05)。3.2.4 RA患者外周血中NF-κB信号通路的相关基因表达的变化与正常对照组相比,RA患者外周血浆Act1、p50、p65、IκBα、IKKα的m RNA水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2.5 RA患者外周血浆中NF-κB信号通路的相关蛋白表达的变化与正常对照组比较,RA患者外周血浆Act1、p50、p65、IκBα蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.6 RA患者外周血浆中miR-155的变化与正常对照组相比,RA患者外周血浆miR-155表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.7 RA患者外周血凝血指标的相关性分析相关性分析显示,D-D与PAF、DAS28、ESR、IL-6、IL-17、P65、关节疼痛、关节压痛、晨僵、食欲减退、关节重着、血瘀总积分、舌质、皮下瘀斑呈正相关(P<0.05),与IL-10、PAF-AH呈负相关(P<0.05);FBG与TXB2、CCP、IL-6、关节重着、脉象呈正相关(P<0.05),与IL-10呈负相关(P<0.05);PLT与PAF、DAS28、IL-6、P65、晨僵、血瘀总积分呈正相关(P<0.05),APTT与ESR、CRP、CCP、皮下瘀斑呈负相关(P<0.05),PT与血瘀总积分呈负相关(P<0.05),与IκBα呈正相关(P<0.05);TT与CCP、RF、P50、血瘀总积分呈负相关(P<0.05),PAF与D-D、PLT、IL-6、IL-17、P65、Act1、大便稀溏、血瘀总积分呈正相关(P<0.05),与IL-4呈负相关(P<0.05);PAF-AH与D-D、P65、晨僵呈负相关(P<0.05),与IL-4、IκBα呈正相关(P<0.05);6-keto-PGF1a与ESR、关节疼痛、舌质呈负相关(P<0.05);TXB2与FBG、DAS28、IL-6呈正相关(P<0.05)。3.2.8新风胶囊治疗RA患者的临床疗效XFC组在治疗第4周、第8周、第12周的ACR20、ACR50、ACR70分别为26.7%/3.3%/0%、58.3%/18.3%/3.3%、85%/66.7%/21.7%;LEF组在治疗第4周、第8周、第12周的ACR20、ACR50、ACR70分别为15%/3.3%/0%、41.7%/11.7%/3.3%、85%/41.7%/15%;卡方检验P值>0.05,说明两组ACR20、ACR50、ACR70间的差异不具有统计学意义。3.2.9新风胶囊对RA患者外周血凝血纤溶指标的影响与治疗前相比,XFC组治疗后D-D、FBG、PLT、PAF、TXB2明显降低,PAF-AH、6-keto-PGF1a明显升高(P<0.05;P<0.05),LEF组治疗后D-D、FBG、TXB2明显降低,6-keto-PGF1a明显升高(P<0.05;P<0.05),PLT、PAF/PAF-AH未见明显改善(P>0.05)。而两组治疗后的APTT、PT、TT均未见明显改变(P>0.05)。与LEF组治疗后相比,XFC组D-D、PLT、PAF/PAF-AH的明显改善(P<0.05)。3.2.10新风胶囊对RA患者外周血致炎/抑炎细胞因子的影响与治疗前相比,XFC组IL-4、IL-10明显升高,IL-17、IL-6明显降低(P<0.05;P<0.05),与LEF组相比,XFC组的IL-17明显下降(P<0.05)。3.2.11新风胶囊对RA患者外周血浆中NF-κB信号通路的相关基因表达的影响与治疗前相比,XFC组Act1、p65、p50、IκBα、IKKαm RNA明显下降(P<0.05),与LEF组相比,XFC组p65m RNA明显下降(P<0.05)。3.2.12新风胶囊对RA患者外周血浆中NF-κB信号通路的相关蛋白表达的影响与治疗前相比,XFC组Act1、p50、p65、IκBα蛋白水平明显下降(P<0.05),与LEF组相比,XFC组p50、p65蛋白水平明显下降(P<0.05)。3.2.13新风胶囊对RA患者外周血浆中miR-155的影响与治疗前相比,两组治疗后miR-155水平明显改善(P<0.05或P<0.01);与LEF对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.2.14新风胶囊对RA患者活动性指标的影响与治疗前相比,XFC组ESR、RF、CRP、CCP、DAS28、Ig G明显下降(P<0.05),与LEF组相比,XFC组ESR、CRP明显下降(P<0.05),而LEF组RF下降明显优于XFC组(P<0.05)。3.2.15新风胶囊对RA患者血瘀症状体征的影响与治疗前相比,XFC组治疗后血瘀症状体征明显改善(P<0.05或P<0.01);与LEF对照组相比,XFC组关节刺痛、舌质、皮下瘀斑、血瘀总积分明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。3.2.16新风胶囊对RA患者生活质量的影响与治疗前相比,XFC组治疗后生活质量明显改善(P<0.05),与LEF组比较,XFC组生活质量总积分、社会功能、健康自我认识能力明显优于LEF组(P<0.05)。3.2.17新风胶囊对RA患者中医证候的影响与治疗前相比,XFC组治疗后关节疼痛、关节肿胀、关节压痛、晨僵均明显好转(P<0.05),且与LEF组治疗后无明显差异(P>0.05)。3.2.18新风胶囊对RA患者脾虚证候的影响XFC组治疗后脾虚的症状均明显改善(P<0.05),而LEF组队食欲减退、少气懒言则无改善(P>0.05),与LEF组相比,XFC组治疗后食欲减退、少气懒言、倦怠乏力、大便稀溏则改善更明显(P<0.05)。3.3体外实验研究新风胶囊能够抑制RA患者的单核细胞IL-6、IL-17的分泌,并且能够抑制单核细胞内miR-155的表达,从而下调miR-155的表达水平,进而抑制IL-6、IL-17的表达水平,抑制单核细胞的促炎症反应。4结论4.1 RA患者体内存在着血瘀状态,其具体表现为血瘀症状体征积分值的升高及凝血指标水平的失调。4.2观察了60例RA患者,发现60例RA患者体内均有凝血指标的升高,且60例患者的血瘀总积分值均高于正常对照组。4.3新风胶囊在改善RA患者临床症状疗效的同时,还能够显著改善RA患者血瘀状态,并且在临床疗效及血瘀状态的疗效上优于对照组。4.4新风胶囊改善RA患者血瘀状态的机制如下:(1)新风胶囊通过调节细胞因子网络的水平的平衡,从而改善血瘀症状,且明显优于来氟米特组。(2)新风胶囊通过调节NF-κB信号通络蛋白的表达水平,从而改善血瘀症状,且明显优于来氟米特组。(3)新风胶囊通过下调miR-155的表达水平,从而改善细胞因子的水平,进而改善血瘀状态。(4)新风胶囊通过调节RA患者体内凝血指标的变化,使其恢复新的平衡状态,继而改善血瘀状态,且明显优于来氟米特组。