中国是梨生产和消费大国,梨的栽培面积和产量均居世界首位。近几年,梨胴枯病在我国危害严重,导致梨树枝梢及剪口处枯死、芽周及桠叉处坏死并沿着枝干不断扩展,严重时引起整株梨树死亡,造成严重的经济损失,已对我国梨产业的发展构成较大威胁。本研究通过对梨主产区胴枯病的广泛调查、样品采集、病原菌分离及种类多样性分析,以明确我国不同梨产区胴枯病菌的种类及其分布状况,来源于梨的间座壳菌在形态特征、致病性及基因序列等方面的差异;同时利用转录组测序技术对间座壳菌及其侵染后的梨枝干组织进行测序及数据分析,拟从转录组水平阐述间座壳菌在不同侵染阶段的致病机制及寄主白梨的防御策略。研究结果为深入了解间座壳属病原菌提供新的信息,并为系统研究间座壳菌的致病机制和梨的抗病机理奠定基础。取得的主要研究结果如下:1.中国梨产区胴枯病病原菌种类鉴定及多样性研究自2014年至2017年,本研究从中国12个省市(重庆、福建、贵州、河北、河南、湖北、江苏、江西、辽宁、山东、云南和浙江)梨产区主栽的砂梨(Pyrus pyrifolia)、白梨(P.bretschneideri)、秋子梨(P.ussuriensis)和西洋梨(P.commmis)上采集表现胴枯病症状的枝干样品286份,通过组织分离法共获得453个梨胴枯病菌分离株,根据菌落形态特征和ITS序列分析的结果,从中选择1 13株作为代表菌株进行多基因位点序列(包括ITS、TEF、CAL、HIS和TUB)联合的系统发育分析和形态学(菌落形态、无性态及有性态等)鉴定,结果显示这些分离物分属于19种间座壳菌,其中已知种13个,分别为山核桃间座壳菌(Diaporthe caryae)、紫荆间座壳菌(D.cercidis)、城固柑橘间座壳菌(D.citrichinensis)、榆树间座壳菌(D.eres)、梭状间座壳菌(D.fusicola)、大麻间座壳菌(D.ganjae)、香港间座壳菌(D.hongkongensis)、稠李间座壳菌(D.padina)、桃间座壳菌(D.pescicola)、大豆间座壳菌(D.sojae)、桃树间座壳菌(D.taoicola)、蜜柑间座壳菌(D.unshiuensis)和毡状间座壳菌(D.velutina);新描述种6个,本研究首次将其分别命名为尖锐间座壳菌(D.acuta)、重庆间座壳菌(D.chongqingensis)、黄褐间座壳菌(D.fulvicolor)、小间座壳菌(D.parvae)、刺状间座壳菌(D.spinosa)和早白酥间座壳菌(D.zaobaisu)。19种间座壳菌的代表菌株接种到活体翠冠梨苗上均产生与田间相同的症状,结果证实这些种均为梨胴枯病的病原菌。但不同地区和不同梨种引起梨胴枯病的病原种类组成存在显著差异,长江流域及其以南地区的病原种类多达19种,而长江以北地区则仅有2种;砂梨和白梨的病原种类分别为15种和7种,西洋梨和秋子梨则各仅有1种。结果表明D.eres在12个省均有分布,可危害4种梨,是中国梨胴枯病的优势病原种。本研究是除D.eres外的18种间座壳菌引起梨胴枯病的首次报道。研究表明,中国梨胴枯病的病原具有丰富的种类多样性。分类结果显示,19种病原间座壳菌中的12个种分属于D.eres、D.sojae和D.arecae三个复合种;形态学特征观测结果显示,病原间座壳菌的不同复合种的菌落色素沉积和a型分生孢子形态存在明显差异;致病力和寄主范围测定结果显示,病原间座壳菌的不同种对不同种质的梨的致病力存在显著差异,D.fusicola和D.chongqsingensi致病力最强,砂梨对病原间座壳菌最敏感,而西洋梨和秋子梨抗性则较强。除梨之外,19种病原间座壳菌中的13个种还可侵染苹果(Malus pumila)、桃(Prunus persica)、猕猴桃(Actinidia chinensis)和柑桔(Citrus reticulata);交配型检测结果显示,19种病原间座壳菌中的13个种为异宗配合型菌株,仅D.sojae为同宗配合型,但D.unshiuensis、D.hongkdongensis、D.cercidis和D.eres菌株中既包含同宗配合型也存在异宗配合型。2.梭状间座壳菌及其侵染白梨枝干组织的同期转录组分析本研究利用转录组测序技术对梭状间座壳菌D.fusicola强致病力菌株DK371及其侵染后的白梨枝干组织进行测序,质控后的转录组数据显示,各样本共获得了有效RNA测序数据量为3.3-13.2 G,Q20、Q30以及CG值均达到高质量标准。对间座壳菌不同侵染时期的差异表达基因(DEGs)进行筛选,D.fusicola转录组和白梨转录组分别筛选到2103和9788个DEGs。并对其分别进行GO注释分类及KEGG富集分析,结果表明发病前期(接种后4d)病原菌D.fusicola的代谢过程较发病后期(接种后11d)更为旺盛,相对地,寄主白梨在发病后期开始激活多种信号通路抵制病原菌的进一步侵入。利用转录组数据深入挖掘寄主白梨对D.fusicola侵染后的应答反应,明确植物与病原菌互作通路、植物激素信号通路、苯丙烷类生物合成通路以及多种转录因子在白梨应答D.fusicola侵染的免疫反应中均发挥关键作用。在白梨和间座壳菌互作过程中,白梨在发病前期主要依赖PTI反应,发病后期ETI反应被逐步激活;同时白梨的应答反应还依赖SA、ABA及ET等植物激素信号通路的共同作用,而JA和IAA等信号通路受到拮抗作用未被激活;在白梨应答间座壳菌侵染的发病前期,苯丙烷类生物合成通路处于激活状态,其中与木质素、花青素合成相关基因显著上调表达。本研究通过对D.fusicola侵染白梨时的碳水化合物活性酶进行注释,深入分析D.fusicola对白梨的侵染适应性,结果显示,D.fusicola中碳水化合物活性酶及植物细胞壁降解酶的数量均接近于半活体营养型真菌,且主要通过降解木质纤维素和果胶完成其对白梨的侵染。本研究对D.fusicola菌株DK371侵染过程中的候选效应子进行筛选,最终筛选到14个最有可能为效应子,其中有4个基因在发病前期和发病后期均显著上调表达,从中选取两个候选效应子(Dfcp1和Dfhp1)进行全长克隆及序列分析,结果表明cDNA测序结果和RNA-seq数据完全一致,且序列在间座壳属真菌内较为保守。荧光定量实验结果证明了Dfcp1和Dfhp1基因在D.fusicola侵染时期均显著上调表达,表明其可能参与D.fusicola对白梨的侵染过程。