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目的:构建人FP~D7基因野生型及突变体真核表达载体,为其进一步的功能研究和临床应用奠定基础。
方法:以RT-PCR法从正常人外周血中扩增人FP,gD7编码序列,用重叠延伸PCR法构建野生型及突变体全长编码序列,定向克隆至载体pEGFP_N1中构建融合质粒。
结果:通过PCR、酶切和测序结果证明重组质粒构建成功。同时与数据库中的已知序列进行对比后扩增序列中第206—251碱基缺失,该缺失区位于第四号外显子的前45碱基,因为丢失的第一个碱基恰位于三联密码子的第二位,导致期间16个氨基酸丢失,并增加了一个甲硫氨酸。为排除实验过程中的误差,我们先后在不同个体的外周血、肾脏、心脏等组织中扩增该部位的序列,共送15个标本,均有此改变。且经仔细分析,缺失碱基前后存在“GT-AT”剪切结构,考虑为该基因在人群中的一个新的选择性剪切体。
结论:人(FR_klI)7野生型及突变体真核表达载体构建成功,并发现一个新的剪切体。