背景:世界上近一半的人口以稻米为食。白叶枯病是侵染水稻(Oryza sativa L.)最为严重的细菌性病害,最早克隆的水稻抗白叶枯病基因Xa21具有广谱抗性,WRKY作为植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育和物质代谢、应对生物及非生物逆境胁迫、氧化衰老的调控等过程中起着重要的作用,因此研究WRKY转录因子在Xa21介导的水稻抗白叶枯病途径中的作用具有重大意义。研究目的:利用制备的水稻WRKY68的特异抗体,调查Os WRKY68在水稻抗白叶枯病过程和各个生长发育时期的表达模式;通过体外表达的WRKY68蛋白质,分析其与Xa21介导的抗病途径中上调的病程相关基因启动子调控区W-box的结合特性;构建Os WRKY68基因的RNAi载体,获得基因沉默的转基因植株,从遗传学角度系统分析水稻WRKY68转录因子的转录和表达特征,了解其在Xa21介导的水稻抗白叶枯病途径中的功能。材料与方法:根据水稻WRKY68的序列,利用软件预测抗原决定簇,人工合成多肽免疫新西兰大白兔,制备WRKY68蛋白质的多克隆抗体。采用Western blotting(WB)技术检测WRKY68蛋白质在水稻接种白叶枯病菌后及正常生长发育过程中的表达特征。利用微量热泳动(Microscale thermophoresis,MST)技术检测WRKY68蛋白质与病程相关基因中顺式元件W-box的亲和力。根据WRKY68的LOC号从水稻基因组注释数据库、MPSS(Massively parallel signature sequencing)网站和Rice XPro(Rice gene coexpression database)网站下载转录数据。用SMART软件对WRKY68蛋白质进行结构域分析。构建WRKY68基因的RNAi载体,以水稻4021为受体进行转化。结果:在水稻接种白叶枯病菌后经WB技术检测出现2条带,其中一条带约为32k Da,和预测分子量相符,其信号强度比较稳定,另外一条带分子量稍大(标注为WRKY68+),在接种后3天被诱导表达,随后表达量呈现上升的趋势;为进一步了解WRKY68蛋白质在水稻与Xoo互作中的表达特征,选取水稻接种后0h、3d和5d的叶片,检测了WRKY68蛋白质在抗、感和对照反应中的表达丰度,发现其表达谱相似,均在接种后期出现分子量较大的诱导条带,但在Mock中均未检测到。MST结果显示WRKY68与PR1b的探针W-1b的解离常数为25n M,当把W-box的核心序列由TGAC突变为CCTA后,其解离常数为353n M,WRKY68与PR10a的探针W-10a和m W-10a的解离常数分别为33n M和39n M,WRKY68与探针W-1a和BS65及其突变形式都不结合,上述结果说明WRKY68与PR1b的W-box特异结合,与PR10a的W-box结合是非特异性的,与PR1a不结合。在水稻不同生育期的叶片中,WRKY68稳定表达,分子量大小与预期相符。转录数据分析发现WRKY68在叶片、花序、花药、雌蕊、种子和胚等组织中均有转录,在雌蕊中的转录水平略高;在水稻接种Xoo后,WRKY68在抗病和感病反应中的转录水平略有下降,但在稻瘟病菌侵染后对WRKY68的转录影响不大;14天幼苗受冷、干旱和盐胁迫后,叶片中WRKY68转录上调;水稻受ABA处理后根中WRKY68的转录水平提高。构建了WRKY68基因的RNAi载体,获得了转基因植株。结论:水稻接种Xoo后出现的诱导条带以及WRKY68与W-box探针的结合,表明WRKY68在Xa21介导的水稻抵抗白叶枯病的途径中发挥作用,这种调控作用很可能是通过下游的PR1b和PR10a起作用的。同时WRKY68在水稻生长各时期的叶片中呈组成型表达,说明其在水稻正常生长发育过程中也起一定的作用。WRKY68转基因植株的获得为从遗传学角度深入探讨该基因的功能奠定了基础。