[目的]目前,多种研究表明自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK)具有无需任何抗原刺激就可以识别和裂解肿瘤细胞的能力,在肿瘤免疫方面发挥重要作用。但NK细胞只是免疫系统的一小部分,仅占白细胞的15%左右,它在人体内存在的量很少,人类到了 25岁以后,免疫力下降,NK细胞数量亦变少,而肿瘤患者及肿瘤术后患者体内NK细胞的数量则更少,活性也更差。因此,如何提高体内NK细胞的数量或在体外培养足够量具有活性的NK细胞回输体内成为激活自身免疫战胜癌症的关键。近年来,由于NK细胞体外扩增方法的发展,使得NK细胞在过继性细胞免疫治疗中的应用变为可能,现在可以将NK细胞从仅几毫升的外周血中扩增成数十亿活化的NK细胞。NK细胞的扩增方法在日本和中国研究较多,但国内外的扩增方法各不相同且繁琐,因此,高质量NK细胞的获得仍是限制其临床应用的关键,为患者治疗提供大量符合良好生产规范标准且拥有功能活性的NK细胞更是一项巨大挑战。本研究的目的是探讨如何建立稳定的NK细胞体外诱导扩增的方法,对扩增的NK细胞进行质控,并验证NK细胞的体内外抗肿瘤活性;获取足够的实验数据,为NK细胞用作自体细胞治疗产品服务临床提供重要的理论支持。[方法]1.自然杀伤细胞诱导扩增体系的建立利用自主构建的人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cell,aAPC)CD137L CD86 CD64 mIL-15-K562细胞作为饲养细胞,与从人血中分离出的外周血单核淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)按照一定比例进行共培养,培养基中外源添加所需细胞因子,以7天作为一个循环进行刺激培养,扩增两个循环后收获NK细胞,进行台盼蓝染色计数,计算NK细胞扩增倍数。2.自然杀伤细胞的鉴定与质控对扩增出的NK细胞进行流式细胞术检测,分析扩增NK细胞的纯度(CD45+CD3-CD56+细胞所占百分比),检测NK细胞代表性表面标志(CD94、CD158、NKp46、NKp44、NKG2D)的表达;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测 NK细胞不同分型的转录因子,鉴定NK细胞谱系来源。3.自然杀伤细胞体外功能验证收获扩增第十四天的NK细胞,使其与肿瘤细胞/成纤维细胞进行共培养,利用细胞共培养杀瘤实验对新鲜培养NK细胞和冻存后的NK细胞的体外杀瘤活性进行检测;酶联免疫吸附实验(Elisa)对共培养上清中释放的细胞因子进行检测;蛋白质免疫印迹技术(Western Blot)对共培养后的NK细胞和肿瘤细胞分别进行细胞毒性相关蛋白和凋亡相关蛋白检测;综合评估NK细胞的体外抗肿瘤活性。4.自然杀伤细胞体内功能验证使用A549肿瘤细胞对裸鼠颈背部进行皮下注射,待小鼠瘤体长至一定体积,采用经尾静脉注射NK细胞治疗荷瘤小鼠,观察治疗小鼠和非治疗小鼠体重及瘤体大小的变化,初步评估NK细胞的体内抗肿瘤活性。[结果]1.NK细胞诱导扩增体系的建立经过14天的体外培养,NK细胞扩增倍数可达1000-1600倍,培养体系重复性好,稳定性强。2.自然杀伤细胞的鉴定与质控流式细胞术检测显示,NK细胞代表性表面标志均有稳定表达,其中CD94和NKp46两个表面标志的表达明显升高;NK细胞纯度可从培养初始占外周单核淋巴细胞(PBMC)10.28±2.0%提升到培养14天占细胞总数88.95±6.17%。RT-PCR检测转录因子的结果显示,NK细胞不同分型的转录因子均有所表达。3.自然杀伤细胞体内外功能验证3.1 NK细胞对肺腺癌细胞SPC-A-1、胃腺癌细胞BGC-823、肺小细胞肺癌细胞A549、淋巴瘤细胞Raji及NAMALWA,白血病细胞K562都具有高效杀伤效应,且效应细胞:靶细胞(即NK细胞:肿瘤细胞)的比例越高,杀伤效果越明显;而对于正常人胚肺成纤维细胞Walvax和包皮成纤维细胞HFF,NK细胞不产生杀伤效果;冻存后NK细胞的杀瘤活性力有所降低,但改良NK细胞的冻存方法后NK细胞的杀瘤活性明显增高;在低氧条件下NK细胞的杀瘤活性几乎不受到影响。3.2上清细胞因子检测:NK细胞与肿瘤细胞的共培养上清较单纯的NK细胞上清表达更多的穿孔素、颗粒酶B及IFN-γ;NK细胞与正常成纤维细胞的共培养上清中穿孔素、颗粒酶B及IFN-γ的表达未有明显升高;可引起细胞因子风暴的相关因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素2(IL-2)及白细胞介素6(IL-6)在单纯NK细胞上清及共培养上清中的表达无差异。3.3蛋白检测:经过肿瘤细胞抗原刺激的NK细胞较单纯的NK细胞表达更多的穿孔素(Perforin),颗粒酶 B(Granzyme B)及γ-干扰素(Interferon--γ,IFN-γ);被NK细胞杀伤过的肿瘤细胞较未做任何处理的肿瘤细胞表达更多的凋亡相关蛋白 Bax、Bad 及 Cleaved Caspase3。3.4荷瘤小鼠NK细胞治疗:A549荷瘤小鼠经过NK细胞治疗后,体重无减轻,瘤体相对未治疗组明显减小。[结论]1.以带有特定共刺激分子的抗原提呈细胞作为饲养细胞与外周单核淋巴细胞按比例进行共培养,并外源性加入细胞因子的方法能够实现NK细胞的大量扩增,方法稳定性好、重复性强;诱导扩增的NK细胞扩增速率快、扩增纯度高。2.正常条件和低氧条件下NK细胞对包括肺腺癌细胞SPC-A-1、胃腺癌细胞BGC-823、淋巴瘤细胞Raji及NAMALWA,白血病细胞K562细胞在内的多种肿瘤细胞都具有高强度的杀瘤活性,但对于正常人包皮成纤维细胞HFF及人胚肺成纤维细胞WalVax没有杀伤作用。3.改良冻存的NK细胞较常规冻存的NK细胞杀瘤活性明显增强,但相较于未冻存的NK细胞,杀瘤活性仍有所降低。4.NK细胞主要通过释放穿孔素/颗粒酶B及分泌IFN-γ途径直接杀伤肿瘤细胞;NK细胞杀伤肿瘤细胞仅释放极少量引起细胞因子风暴的细胞因子,如TNF-α、IL-2 及 IL-6。5.经过NK细胞治疗的A549荷瘤小鼠瘤体明显减小,诱导扩增的NK细胞具有良好的体内抗肿瘤活性。