第一部分：索拉非尼联合放射抗人肝细胞癌放射增敏效应的体外及体内实验研究目的：观察索拉非尼联合放射对人肝癌细胞株SK-Hep-1及其裸鼠移植瘤的抑瘤效应,明确索拉非尼与放射是否具有协同抗肝细胞癌效应并对两种方法联合应用的有效方式进行探讨。材料与方法：研究分体外及体内实验。体外实验中：(1)细胞增殖毒性试验。采用CCK-8法,测出索拉非尼作用SK-Hep-1细胞株48小时的半致死浓度(IC50),进而确定索拉非尼用于放射增敏实验的合适浓度。(2)克隆形成实验。分为3组,分别给予单纯放射、索拉非尼作用48小时后同步联合放射、放射后序贯应用索拉非尼作用48小时。根据各剂量点存活分数(SF),经多靶单击数学模型拟合,获得细胞存活曲线,将联合处理组与对照组进行参数D0、SF10%、SF1%比较,得出放射增敏比(SER)。体内实验中：(1)建立人肝癌细胞株SK-Hep-1裸鼠移植瘤模型。(2)荷瘤裸鼠分为3组：单纯放射组、30mg/kg索拉非尼灌胃7天后放射组、100mg/kg索拉非尼灌胃7天后放射组。放射剂量分别为单次0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy。观察各组肿瘤的生长延迟时间,比较肿瘤体积生长至原先2倍的生长延迟。经Gompertz模型拟合获得肿瘤的剂量效应曲线,将联合处理组与单纯放射组进行参数比较,计算出剂量修饰因子(DMF)。结果：体外实验中,索拉非尼作用48小时对SK-Hep-1增殖的IC50为9.5625μM,索拉非尼浓度选用1μM,用于联合放射组的克隆形成实验。多靶单击模型拟合得出,索拉非尼同步联合放射的SER(DO)、SER(SF10%)及SER(SF1%)分别为1.1、1.3、1.2。体内实验中,30mg/kg索拉非尼联合放射2Gy、4Gy、6Gy、8Gy后的TGD分别为5.3天、15.1天、19天、20.9天；100mg/kg索拉非尼联合放射2Gy、4Gy、6Gy、8Gy后的TGD分别为10.9天、16.6天、20.3天、22.6天。30mg/kg及100mg/kg索拉非尼联合放射的DMF分别为1.3至1.8,以100mg/kg索拉非尼联合放射更明显。结论：体外及体内实验结果显示,索拉非尼同步联合放射有放射增敏效应。第二部分：索拉非尼同步联合放射抗人肝细胞癌放射增敏机制的实验研究目的：第一部分实验结果表明,索拉非尼同步放射治疗人肝癌细胞株SK-Hep-1有放射增敏作用。本研究探讨索拉非尼放射增敏效应的机制。材料与方法：(1)SK-Hep-1细胞经1μM索拉非尼处理48小时后同步放射OGy、1Gy、2Gy、6Gy,应用Western blot法检测细胞蛋白VEGFR-2.ERK、NF-κB及Ku 70磷酸化及非磷酸化表达,与单纯放射组进行比较。(2)给予SK-Hep-1细胞OGy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy放射后,应用ELISA法检测放射后0h、24h、48h、72h不同时期培养液内VEGF含量；并用RT-PCR检测在0Gy、1Gy、2Gy、6Gy、8Gy放射后24h、48h,细胞的VEGF mRNA表达,观察放射对人肝癌细胞分泌VEGF的影响、放射是否可以引起人肝癌细胞株过分泌VEGF。结果：(1)Western blot检测结果：单纯放射后,DNA修复蛋白Ku 70磷酸化水平略增高；1μM索拉非尼处理后,VEGFR-2及Ku 70磷酸化明显抑制；索拉非尼同步联合放射后,VEGFR-2、ERK及Ku 70蛋白的磷酸化均明显受抑制：NF-κB的磷酸化在索拉非尼联合6Gy放射后有轻度抑制。(2)ELISA检测结果：放射后,VEGF浓度整体上高于对照组,且增长幅度强于对照组；在24h及48h时以2Gy放射组显著,在72h时,放射组VEGF浓度均高于对照组,1,2,4,6Gy组增高显著(P<0.05),其中1Gy组最明显,8Gy组不明显(P>0.05)。在放射组中,以1、2、4、6Gy放射后48h-72h培养液中VEGF浓度为最高,放射剂量继续增加并不能引起VEGF的升高；72h时,8Gy组与对照组相比无显著差异,明显低于1、2、4、6Gy组。8Gy高剂量放射诱发VEGF增高的效应并不明显,可能与高剂量放射后细胞死亡增加显著有关。(3)RT-PCR结果SK-Hep-1细胞8Gy放射24h后VEGF mRNA表达增强,48h后更为明显；放射1Gy、2Gy、6Gy后48h,VEGF mRNA表达也明显上升；而对照组(0Gy)在24h及48h时VEGF mRNA表达无明显差异。用FR-2000型图像分析系统对电泳图像进行光密度扫描,计算得到VEGF mRNA的相对转录量(与β-Actin mRNA光密度值的比值),结果显示,VEGF mRNA的表达随放射剂量及放射后时间的延长,有加速升高的趋势,在8Gy放射后最为明显。结果提示,未放射时SK-Hep-1细胞培养液中VEGF浓度随时问延长的升高,是由于培养瓶中VEGF的长期蓄积；而受放射后VEGF的进行性加速升高,与放射诱导的VEGF mRNA表达增强有关。结论：索拉非尼放射增敏机制可能为：放射诱发SK-Hep-1细胞过高分泌VEGF,且通过上调DNA修复蛋白的表达加速DNA损伤修复；索拉非尼同步联合放射后,可通过抑制VEGFR-2、ERK1/2及Ku 70的磷酸化,从而抑制放射后肿瘤细胞DNA损伤的修复,起到放射增敏作用。在体索拉非尼的放射增敏机制可能是：索拉非尼抑制放射后肿瘤细胞DNA损伤的修复；同时,放射可引起人肝癌细胞过度分泌VEGF,增加肝细胞癌(HCC)的增殖；而索拉非尼单独或联合放射均可明显抑制VEGFR-2磷酸化,从而可以减少细胞膜VEGFR-2与胞外VEGF的活性结合,从而在体内可减少肿瘤新生血管形成,延缓或抑制肿瘤的生长。本实验研究结果提示,在临床使用放射治疗HCC时,同步联合应用索拉非尼有可能增强局部疗效,同时减少放射诱发的VEGF升高,降低复发及远地转移的几率第三部分：肝硬化大鼠模型建立及肝硬化自然消退中肝再生的研究目的：我们在对硬化肝脏放射后的肝再生进行实验研究时,需要在肝硬化形成后继续观察120天。为此我们建立一个适合长时期观察的肝硬化动物模型,并对肝硬化自然消退过程中的肝功能及肝再生进行研究,所得到的数据可以作为基础值,更好的理解、解释放射实验的结果。材料与方法：给予112只Wistar大鼠饮用0.03%硫代乙酰胺(TAA)29周,来建立肝硬化动物模型。肝硬化模型建立后,将TAA撤除,继续观察120天,每隔30天处死5只大鼠,获取肝脏和血液样本,观察硬化及肝再生的动态变化。(1)全自动生化仪检测血清ALT、AST、ALP及PA,观察肝功能变化；(2)三色染色观察胶原纤维含量、血清TGF-β1浓度、TGF-β1免疫组化染色表达及肝TGF-β1 mRNA表达、肝羟脯氨酸含量,以此观察肝硬化的动态变化；(3)肝脏指数、H&E染色分析肝细胞有丝分裂指数(MI)、流式细胞术检测肝细胞增殖分数(PI)、PCNA免疫组化染色表达及qRT-PCR检测肝脏PCNA mRNA表达,用于分析肝再生变化；(4)ELISA法检测血清肝再生相关生长因子HGF、VEGF、TGF-α及IL-6。结果：大鼠应用TAA29周后,经病理检测证实形成肝硬化,模型建立,建模率96%。模型建立时,表现为明显肝再生,伴肝功能不全。撤除TAA后,大鼠肝硬化出现白发消退,肝脏胶原纤维减少、羟脯氨酸含量下降、肝脏TGF-β1表达下调。在肝硬化消退时,伴随肝功能的改善。在肝硬化消退120天后,明显肝纤维化仍然可见。撤除TAA后,肝再生显著降低,肝细胞MI、PI、PCNA mRNA表达下降,免疫组化PCNA阳性染色比例下降,此外,血清HGF和VEGF也出现下降。结论：肝硬化大鼠动物模型可以经口服0.03%TAA29周后诱导形成。肝硬化能发生自发消退,消退过程中肝功能改善、肝再生下降。此模型形成的肝硬化可以维持120天以上,适合需长时期观察的研究使用。第四部分：硬化肝脏放射后肝损伤及肝再生的实验研究目的：研究肝硬化大鼠右半肝脏给予亚致死性放射后,是否能产生肝再生、是否能触发未放射的左半肝肝脏出现肝再生材料与方法：将研究分成连续的两个实验。实验一中,肝硬化大鼠分成4组,即对照组(未放射)、5-0Gy、10-0Gy及15-0Gy组,后3组分别给予右半肝单次放射5Gy、10Gy及15Gy,左半肝不放射。将放射前定义为d0,放射后观察120天,每隔30天,分别于d30、d60、d90及d120每组处死5只大鼠,获取血清和肝脏标本进行肝损伤与肝再生评价。实验二的设计依赖于实验一结果。实验一结果显示,右半肝放射5Gy、10Gy、15Gy均能引起放射半肝及未放射半肝发生肝再生,以15Gy为最明显。实验二中,将肝硬化大鼠分成5组,分别为假照对照组(0-0 Gy)、15-0Gy、15-2.5Gy、15-5Gy及15-7.5Gy组,后4组选择15Gy作为初始刺激放射右半肝,并同时分别放射左半肝0Gy、2.5Gy、5Gy及7.5Gy。将放射前定义为d0,放射后观察150天,每隔30天,分别于d30、d60、d90、d120及d150每组处死5只大鼠,获取血清和肝脏标本进行肝损伤与肝再生评价。实验一及实验二的观察指标相同：(1)肝损伤：大鼠体重、血清ALT、AST、ALP及PA；(2)肝再生：肝脏指数、H&E染色分析肝细胞有丝分裂指数(MI)、流式细胞术检测肝细胞增殖分数(PI)、PCNA免疫组化染色表达及qRT-PCR检测肝脏PCNA mRNA表达、ELISA法检测血清肝再生相关生长因子HGF、VEGF、TGF-α及IL-6；(3)血清TGF-β1浓度、TGF-β1免疫组化染色表达及肝TGF-β1 mRNA表达。结果：单纯给予右半肝5Gy、10Gy、15Gy放射,或者给予右半肝15Gy放射同时左半肝放射2.5Gy、5 Gy、7.5Gy,均可引起肝再生,且在左右半肝均发生。肝再生指标中,PCNA免疫组化阳性染色比例、PCNA mRNA表达、PI、MI明显升高,以左半肝略显著；同时血清HGF、VEGF、IL-6浓度均显著升高。放射后肝功能受损,血清ALT、AST、ALP、TGF-β1升高,PA降低,肝组织中TGF-β1表达明显增高,以右半肝显著。随放射剂量及放射肝体积增加,肝再生与肝损伤表现更显著。实验中大鼠死亡率均不高于11.11%,实验使用的放射剂量及范围对肝硬化大鼠致死性不高。结论：硬化肝脏能耐受一定程度的放射,15Gy的亚致死性部分肝脏放射可以在放射肝及未放射肝,引起剂量和体积依赖性肝损伤与肝再生。组织学上,肝损伤在受到更高剂量放射的右半肝更明显,而肝再生在接受较低剂量的左半肝更显著。