柴胡始载于《神农本草经》,为常用中药。中国药典2005年版收载北柴胡Bupleurum chinese DC.和红柴胡(狭叶柴胡)B.scorzonerifolium Willd.两种。但据文献记载和实地调查,柴胡属植物的绝大多数种类在产地均作药用柴胡,并且在生长地常常有数种柴胡混杂生长。由于药用柴胡使用品种混乱,化学成分复杂,有效成分含量相差悬殊,造成柴胡及其制品质量的不稳定。柴胡为河北省道地药材,主要分布有北柴胡、烟台柴胡、百花山柴胡、兴安柴胡、红柴胡、黑柴胡等,另外,三岛柴胡在我省大面积种植栽培。本实验利用传统的鉴别方法如性状、显微、理化鉴别并采用细胞生物学、分子生物学等现代分析技术对柴胡属种子进行综合的鉴别研究。从而为鉴别柴胡属种子的物种提供科学依据;同时对柴胡GAP生产的实施,保证种质资源的稳定性、可控性具有指导意义,为规模化、规范化种植提供可靠的依据。本实验方法快速、简便、实用,能满足基层需要,为柴胡种子的品种鉴定、开发和应用奠定了科学基础。第一部分性状、显微、理化鉴别目的:应用快速、简便、实用的方法,建立柴胡种子的外观性状、显微特征、理化性质方面的综合鉴别信息指征。方法:1外观性状观察。2脱色表面片制备:(1)脱色:拨取种皮切成1~2 mm小块浸入水合氯醛(1:1)水溶液中。(2)压片观察。3石蜡横切片制备:(1)取材和固定:种子用蒸馏水4℃浸泡一周以上,F.A.A固定液固定两周以上。(2)脱水:依次用浓度为70 %、80 %、90 %、95 %的乙醇溶液、无水乙醇进行脱水,每隔2~3 h调换溶液。(3)透明:二甲苯:无水乙醇(1:1)浸种1 h后,转入二甲苯中至种子透明为止。(4)浸蜡:65℃恒温箱中进行,半小时调蜡一次,至种子完全浸透。(5)包埋和切片:石蜡包埋,切片厚度12μm。(6)贴片和熔蜡。(7)染色:番红-固绿双重染色。(8)脱水与封藏。4种皮扫描电镜观察:(1)清洗:取种子用50 %乙醇超声清洗5 min。(2)脱水:50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %乙醇逐级脱水,每一级脱水两次,每次30 min,其间不断震荡清洗。(3)固定:戊二醛固定30 min。(4)电镜观察:真空喷金后,进行观察。5紫外扫描图谱特征:(1)取适量柴胡种子粉末,用不同极性的试剂,依次为石油醚、乙酸乙酯、无水甲醇,索氏提取3 h,分别制备供试液A、B、C。(2)扫描波长为200~400 nm的紫外吸收图谱。(3)图谱分析。6薄层色谱鉴别:(1)分别将供试液A、B浓缩,供点样;(2)点样,展开。(3)显色、观察、照相。结果:1宏观性状:几种柴胡种子均为双悬果,短圆柱形,具两个分果,其分果呈长椭圆形,顶端残留黄棕色突起的柱基,基部有的有细小的分果柄,每个分果有5条纵棱,整体性状相似不易区分。2脱色表面片:几种种子在种皮细胞形状、细胞壁增厚情况、气孔类型和油管等方面无明显的区别。3石蜡横切片:几种种子在种皮细胞层数和油管的数目、直径大小等特征上都有明显差别。4扫描电镜观察:几种种子的超微特征有一定的差别。5紫外扫描图谱:利用不同极性试剂分别对几种柴胡种子提取,可以定性或定量的鉴别柴胡种子。其中石油醚提取部分的吸收峰数目和位置有一定的差别。6薄层色谱:几种柴胡种子提取液的薄层图谱有一定差别,可用于鉴别。结论:柴胡属不同种植物的种子在外观性状、显微特征、理化性质存在差异,由此可以用于鉴别。方法快速、简便、实用,适用于几种柴胡种子的快速鉴别。第二部分细胞生物学及分子生物学特征研究目的:利用染色体组型分析、种子蛋白质PAGE、SDS-PAGE技术及RAPD技术研究几种柴胡种间的综合鉴别信息指征,从细胞水平及分子水平鉴别真伪,并为柴胡种子的品种筛选提供依据。方法:1根尖体细胞染色体标本片制备:(1)预处理:挑选饱满的种子,于25℃下萌发,待根尖长到1.0~2.0 cm时,切取约2 mm的根尖于蒸馏水中4℃低温处理24 h(。2)固定:卡诺固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)固定1.0~1.5 h。(3)解离:95 %乙醇:浓盐酸解(1:1)离8~15 min。(4)后低渗:重蒸水低渗,时间10~15 min。(5)染色:改良石炭酸品红液染色。(6)封片:冰冻后揭去盖片,中性树胶封片。(7)显微照相、计数、测量。2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征研究:(1)制备供试品溶液。(2)制备分离胶和浓缩胶。(3)电泳:恒定电压120~180 V。(4)染色和洗脱:考马斯亮蓝(R-250)染色,脱色液洗脱至背景清晰为止。(5)结果分析:绘图并测定特征谱带的泳动率。3 RAPD技术鉴别:(1)高盐低pH法提取纯化植物总DNA。(2)PCR扩增及引物筛选。(3)图谱分析。结果:1根尖体细胞染色体组型特征:柴胡属植物种子在染色体数目上不尽相同,北柴胡,及其变型烟台柴胡、百花山柴胡的染色体数目均为2n=12,而三岛柴胡的染色体数目为2n=26,兴安柴胡的染色体数目为2n=64,红柴胡染色体数目为2n=12,黑柴胡染色体数目为2n=12;再者,几种柴胡种子的染色体的长度、变异系数有明显区别。2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征:北柴胡,及其变型烟台柴胡和百花山柴胡的谱带数目和位置稍有不同;而北柴胡、三岛柴胡、兴安柴胡、红柴胡、黑柴胡之间有明显区别。3 RAPD鉴别研究:筛选出可对几种柴胡种子进行有效扩增的引物条,对柴胡种子扩增得到的条带在数目和位置上均有明显差异,可用于鉴别。结论:应用生物学技术对柴胡种子进行鉴别研究,可以较根本的揭示柴胡属种间的差异,为柴胡种源筛选提供依据。