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乳腺癌是发生在女性中最常见的肿瘤之一，并且由于其易发生恶性转移而成为第二致命的女性恶性肿瘤。在乳腺肿瘤的炎性微环境中，肿瘤相关的中性粒细胞（TAN）在肿瘤发生和肿瘤进展中起着至关重要的作用，其中中性粒细胞外诱捕网（NET）的释放便是重要的机制之一。本实验探究并证实了乳腺癌细胞是如何诱导NET的形成以及NETs在乳腺癌细胞转移中的作用。
目的：
研究乳腺癌细胞分泌的细胞因子IL-8对NET形成的作用；探究NETs对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移的影响以及在NETs刺激后乳腺癌细胞发生转移的信号途径的变化；分析NETs水平与乳腺癌患者临床病理特征之间相关性，为研发检测乳腺癌的标记物提供新思路。
方法：
1.使用免疫荧光染色实验测定NET的形成；
2.使用ELISA实验通过测量髓过氧化物酶（MPO）DNA水平检测乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中的NETs的水平；
3.采用Transwell实验检测NETs对乳腺癌细胞转移的作用；
4.利用ELISA实验通过测量NETs-DNA水平检测50例乳腺癌患者肿瘤组织和对应正常乳腺组织的组织匀中NETs的水平；
5.使用Western-Blot实验检测各组乳腺癌细胞的AKT,pAKT,STAT3以及pSTAT3蛋白表达的变化。
结果：
1.NETs-DNA与MPO-DNA的ELISA实验结果表明，与相对应的正常乳腺组织相比，肿瘤组织中的NETs水平显著升高（P<0.01）。免疫组织化学染色结果显示，乳腺肿瘤组织中IL-8染色显著阳性。IL-8的ELISA实验结果表明，与相对应的正常乳腺组织相比，肿瘤组织匀浆的IL-8水平显著升高（P<0.01）。IL-8水平与NETs水平的相关性分析结果表明，乳腺肿瘤组织中IL-8水平与NETs水平呈正相关（r=0.6742）。
2.MPO-DNA的ELISA实验结果显示，在中性粒细胞培养基中加入IL-8后，MPO-DNA的含量显著增加即NET的形成显著增加。在正常乳腺细胞MCF10A以及MCF7，T47D，BT474和MDA-MB-231乳腺癌细胞系培养上清中细胞因子的检测结果表明，IL-8是分泌量最多的细胞因子，且在MDA-MB-231细胞系中分泌量最高（P<0.05）。中性粒细胞的免疫荧光染色结果显示，加入MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞的培养上清液时NET的形成增加，而同时加入IL-8阻断剂后NET的形成显著降低（P<0.05）。
3.Transwell实验的结果表明，在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系培养上清液中均添加NETs后，乳腺癌细胞的迁移量增加，而在添加DNase I降解NETs后，乳腺癌细胞的迁移量显著降低（P<0.05）。Western Blot实验的结果表明，在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系中，在NETs的刺激下细胞的P-AKT和P-STAT3的蛋白表达水平均显著增加，且在添加相应的AKT和STAT3蛋白抑制剂后，P-AKT和P-STAT3的蛋白表达水平均显著减弱。
4.乳腺癌患者的临床病理特征与对应的NETs水平数据分析结果表明，高NETs水平组的乳腺癌患者肿瘤的远处转移率为41.2％，低NETs水平组的乳腺癌患者肿瘤的远处转移率为3.6％，差异有统计学意义（p=0.007）。
结论：
1.乳腺癌组织中的NETs水平与IL-8水平呈正相关性；
2.乳腺癌细胞能够通过分泌细胞因子IL-8诱导NET的形成；
3.NETs能够通过激活AKT和STAT3信号通路促进乳腺癌细胞的迁移；
4.乳腺癌患者肿瘤组织中的NETs水平与乳腺癌的远处转移率相关。
目的：
研究乳腺癌细胞分泌的细胞因子IL-8对NET形成的作用；探究NETs对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移的影响以及在NETs刺激后乳腺癌细胞发生转移的信号途径的变化；分析NETs水平与乳腺癌患者临床病理特征之间相关性，为研发检测乳腺癌的标记物提供新思路。
方法：
1.使用免疫荧光染色实验测定NET的形成；
2.使用ELISA实验通过测量髓过氧化物酶（MPO）DNA水平检测乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中的NETs的水平；
3.采用Transwell实验检测NETs对乳腺癌细胞转移的作用；
4.利用ELISA实验通过测量NETs-DNA水平检测50例乳腺癌患者肿瘤组织和对应正常乳腺组织的组织匀中NETs的水平；
5.使用Western-Blot实验检测各组乳腺癌细胞的AKT,pAKT,STAT3以及pSTAT3蛋白表达的变化。
结果：
1.NETs-DNA与MPO-DNA的ELISA实验结果表明，与相对应的正常乳腺组织相比，肿瘤组织中的NETs水平显著升高（P<0.01）。免疫组织化学染色结果显示，乳腺肿瘤组织中IL-8染色显著阳性。IL-8的ELISA实验结果表明，与相对应的正常乳腺组织相比，肿瘤组织匀浆的IL-8水平显著升高（P<0.01）。IL-8水平与NETs水平的相关性分析结果表明，乳腺肿瘤组织中IL-8水平与NETs水平呈正相关（r=0.6742）。
2.MPO-DNA的ELISA实验结果显示，在中性粒细胞培养基中加入IL-8后，MPO-DNA的含量显著增加即NET的形成显著增加。在正常乳腺细胞MCF10A以及MCF7，T47D，BT474和MDA-MB-231乳腺癌细胞系培养上清中细胞因子的检测结果表明，IL-8是分泌量最多的细胞因子，且在MDA-MB-231细胞系中分泌量最高（P<0.05）。中性粒细胞的免疫荧光染色结果显示，加入MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞的培养上清液时NET的形成增加，而同时加入IL-8阻断剂后NET的形成显著降低（P<0.05）。
3.Transwell实验的结果表明，在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系培养上清液中均添加NETs后，乳腺癌细胞的迁移量增加，而在添加DNase I降解NETs后，乳腺癌细胞的迁移量显著降低（P<0.05）。Western Blot实验的结果表明，在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系中，在NETs的刺激下细胞的P-AKT和P-STAT3的蛋白表达水平均显著增加，且在添加相应的AKT和STAT3蛋白抑制剂后，P-AKT和P-STAT3的蛋白表达水平均显著减弱。
4.乳腺癌患者的临床病理特征与对应的NETs水平数据分析结果表明，高NETs水平组的乳腺癌患者肿瘤的远处转移率为41.2％，低NETs水平组的乳腺癌患者肿瘤的远处转移率为3.6％，差异有统计学意义（p=0.007）。
结论：
1.乳腺癌组织中的NETs水平与IL-8水平呈正相关性；
2.乳腺癌细胞能够通过分泌细胞因子IL-8诱导NET的形成；
3.NETs能够通过激活AKT和STAT3信号通路促进乳腺癌细胞的迁移；
4.乳腺癌患者肿瘤组织中的NETs水平与乳腺癌的远处转移率相关。