真核生物体复杂成熟的表型是内部多层转录调节网络的综合相互作用结果。转录调控网络由通过交换蛋白质相互作用的转录单元（Transcription Unit:TU）组成。在真核细胞中,转录单元主要由三个部分,即启动子（Promoter）,编码序列（Codon sequence:CDS）和终止子（terminator）组成。其中,启动子操纵子（Operator）部分。操纵子是转录因子（Transcriptionfactor:TF）结合的部位。转录因子又称反式作用元件,主要包含两个功能结构域:DNA结合域（DNAbinding domain:DBD）和转录调节域（Regulation domain:RD）。其中,DBD 是与启动子中操纵子结合的位点,RD则是通过与其他蛋白相互作用控制目的蛋白的转录激活（Transcriptionactivation）或抑制（Transcriptionrepression）。合成转录调控网络的构建应当与它的底盘生物正交,即构建的转录调控网络不能干扰宿主生物的分子生物学功能。目前,在酿酒酵母中,利用细菌转录因子（例如TetR和LacI）和经过其相应的操纵子修饰后的启动子已经实现了正交回路的构建。但是,细菌的TF及其操纵子主要适用于由少量TU构成的回路,难以满足含有大量正交TF的复杂基因调节网络的需要。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）-Cas（CRISPR-associated）系统是一种细菌和古生菌体内由RNA介导的获得性免疫系统,可以保护细菌和古生菌免受外源基因或噬菌体的侵染。CRISPR-Cas系统主要由两部分组成即CRISPR array序列（编码CRISPRRNA（crRNA）的形成）和Cas基因——翻译出的Cas蛋白效应器对外源入侵的DNA基因进行切割降解。其中前者CRISPR array序列主要由一些不连续的高度保守的DNA序列（称为直接重复序列:Direct repeat）和间隔序列（Spacer）组成（间隔序列来源于外源基因的第一次入侵）。目前,CRISPR-Cas系统根据Cas效应蛋白的组成不同被分为两大类,六种类型。第一类中的Cas蛋白效应器由多种不同的Cas蛋白组成,主要包括Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型,而第二类中Cas基因编码出的Cas蛋白是单一的,含有多功能域蛋白效应器,如Ⅱ型中的Cas9,Ⅴ型中Cas12,和Ⅵ型中的Cas13。CRISPR-Cas系统发挥作用的另一个重要因素是外源基因中的原间隔临近序列（Protospacer adjacent motif:PAM）。PAM序列通常只存在于外源基因中,是细菌和古生物区别自身基因和外源入侵者的关键。当CRSIPR-Cas系统对抗外源基因时,Cas蛋白和crRNA首先形成Cas:crRNA二元复合物,随后Cas蛋白效应器通过PAM作用域（PAM Interaction:PI）识别外源基因序列中的PAM结构,并与之发生相互作用,然后Spacer序列根据碱基互补配对原则与临近PAM序列的靶基因结合,最后靶DNA双链在Cas蛋白的作用下被切割,随之被降解。2015年,Zetsche等人鉴定了 Cpf1,属于V-A亚型CRISPR-Cas系统中的Cas相关蛋白,后来该类蛋白被命名为Cas12a。目前,CRISPR-Cas12a基因编辑技术已被广泛用于各种生物中,如细菌,酵母,植物。此外,基于在不同细菌来源的催化失活的 Cas12a（Catalytically deactivated Cas12a:dCas12a）蛋白上新的合成的转录因子也已经在不同底盘生物体中得到了灵活的运用。例如,最初使用dAsCas12a（来自Acidaminococcussp.BV3L6）作为转录阻遏物用于细菌和植物。随后,通过将dAsCas12a蛋白与激活域（Activation domain）或抑制域（Repression domian）融合,形成的新的TFs被证明可以激活或抑制哺乳动物细胞中的内源基因表达。此外,在生物传感器中使用基于dLbCas12a系统的激活剂（来自Lachnospiraceae bacterium）,用来检测哺乳动物细胞中与肿瘤相关的信号因子已经实现。最近,Yu等也报道了裂殖酵母中基于dFnCas12a（来自Francisella novicida）的转录抑制效应。尽管这些研究表明CRISPR-dCas12a系统可以作为TFs用于高等真核生物,但仍不清楚基于dCas12a的TFs在酿酒酵母中的调控。目前,关于CRISPR-dCas12a系统能否用作转录调节因子（包括激活剂和抑制剂）用于酿酒酵母底盘生物中的相关问题并没有被探究,而且基于CRISPR-dCas12a TFs的合成转录调控回路在酿酒酵母中也没有被构建。因此,本次研究的目标之一是探究三种来源不同菌属的（d）Cas12a蛋白即denAsCas12a,dLbCas12a,dMbCas12a（来自Moraxella bovoculi）是否可用作转录激活剂（通过将dCas12a蛋白与AD:VP64,VPR融合,招募更多的RNA聚合酶Ⅱ,以此来提高靶蛋白的表达水平）或转录抑制剂（与CDS序列结合阻断RNA聚合酶Ⅱ对靶基因的转录过程）在酿酒酵母中调节合成转录回路的靶蛋白（绿色荧光蛋白yEGFP）的表达水平——增强或减弱。共同进化理论显示,自然界中当生物体为了避免自身被入侵者灭绝而衍生出一种新的机制来对抗外来入侵者时,该入侵者同样也会产生适当的对策,作出反应来规避宿主生物体的反抗以确保自身的存活。作为对CRISPR-Cas12a的反击,噬菌体同样也开发了多种抗（Anti-）CRISPR相关蛋白（Acr）,以此来阻断细菌或古生物体内CRISPR-Cas的免疫功能。2013年,Bondy-Denomy等人首次在细菌体（Pseudomonas aeruginosa）内发现了抗 CRISPR-Cas Ⅰ 型蛋白（AcrIs）。随后,抗CRISPR-Cas9的蛋白（AcrIIs）也相继在不同的细菌和古生物中被报导。2018 年,5 种抗 CRISPR-Cas12a 的蛋白（AcrVAs）即 AcrVA1-AcrVA5 在Moraxella bovoculi细菌中被发现。但是根据相关文献显示,只有AcrVA1,AcrVA4和AcrVA5这3种蛋白可以明显阻断CRISPR-Cas12a的体内外基因编辑作用,并且对宿主细胞（细菌和哺乳动物细胞）的生长不会产生任何的毒性作用。因此,在本次研究中,我们仅探究了 AcrVA1,AcrVA4和AcrVA5这3种抗V-A蛋白在酿酒酵母中的作用。虽然这三种V-A型抗CRISPR蛋白（AcrVA1,AcrVA4和AcrVA5）都来源于同一菌属,但是它们对于CRISPR-Cas12a功能的阻断作用却存在明显差异。与AcrVA4和AcrVA5相比,AcrVA1具有抑制广谱性。AcrVA1可以在细菌和哺乳动物细胞中不同程度地抑制AsCas12a,LbCas12a和MbCas12a系统对靶基因的切割作用。AcrVA4和AcrVA5不能阻断AsCas12a蛋白对底物DNA的切割,但是会在体外和体内（HEK-293T细胞）降低MbCas12a和LbCas12a的基因编辑效率。2019年,通过生物化学和结构生物学实验,人们相继阐明了这三种抗V-A蛋白的作用机制。研究表明AcrVA1,AcrVA4和AcrVA5都是通过阻止Cas12a:crRNA复合物与底物DNA结合来抑制Cas12的切割活性。AcrVA1通过模仿PAM序列来阻止Cas12a:crRNA复合物与靶DNA结合,进而阻止Cas12a对底物DNA的切割作用。此外,将Cas12a:crRNA复合物与AcrVA1蛋白一起孵育后,crRNA序列在体外被降解,这意味着AcrVA1具有crRNA的切割活性。最近相关文献报导,在人类细胞中实现了 AcrVA1介导的OFF开关,以控制多输入与门内合成激活剂dLbCas 12-miniVPR的活性。AcrVA4的和抑制机制与AcrVA1不同。AcrVA4通过三种不同的方式破坏Cas12a:crRNA与DNA之间的相互作用。首先,AcrVA4诱导Cas12a:crRNA复合物二聚化,然后与Cas12a蛋白结构中的盐桥结合以此来削弱催化活性所需的Cas12a构象变化。其次,在高浓度下,AcrVA4会激发DNA从Cas12a:crRNA:DNA三元复合物中解离。第三,AcrVA4在DNA被切割后阶段依然发挥抑制作用,这意味着它还可以与Cas12a:crRNA-truncated（截短后的）-dsDNA三联体结合,以此来阻断Cas12a:crRNA的再利用功能。AcrVA5与AcrVA1和AcrVA4完全不同。Dong等发现AcrVA5是一种乙酰基转移酶,可共价修饰MbCas12a的K635残基和LbCas12a的K596（赖氨酸在PAM识别中很重要）,从而导致Cas12a永久失活。尽管V-A型抗性蛋白从发现到机制研究发展很快,但目前并没有相关文献证明在酿酒酵母中该类蛋白是否可用作开关控制CRISPR-（d）Cas12a转录因子的作用。并且,根据文献调研,到目前为止,关于V-A型抗CRISPR蛋白是否可用作调控元件用于酵母合成基因回路构建的问题没有被探究。因此,本次研究的目标之二就是探究AcrVA1,AcrVA4和AcrVA5这3种抗V-A蛋白在酿酒酵母中对CRISPR-dCas12a的抑制作用以及它们的作用特点。在这项工作中,我们探索了三种dCas12a蛋白（denAsCas12a,dLbCas12a和dMbCas12a）是否可用作酵母细胞中的激活剂和阻遏剂调控外源GFP蛋白的表达并探究了三种不同类型的V-A抗CRISPR蛋白AcrVA1,AcrVA4和AcrVA1控制其活性的可能性。我们的研究数据表明在酿酒酵母中,两种dCas12a蛋白（denAsCas12a和dLbCas12a）既可以用作激活剂（通过将dCas12a蛋白与强激活域VP64或VPR融合）又可以是阻遏物来控制靶基因的表达,而dMbCa12a（与AcrVAs来源于同一菌属）不能作为转录因子对目的蛋白进行调控。此外,AcrVA1,AcrVA4 和 AcrVA5 能够抑制 denAsCas12a（仅 AcrVA1）和 dLbCa12a转录因子的调控作用。根据实验数据,dCas12a-ADs的激活效率表现出对crRNA结合位点（即操纵子）数量的依赖性,而与细胞中crRNA的数量没有直接关系。通常,基于denAsCas12a的TFs的性能要优于基于dLbCas12a的TFs。AcrVAs在不同程度上抑制了基于dCas12a的TF。AcrVA1的抑制作用似乎在很大程度上取决于其自身浓度和合成回路中结构组成。相反,对于AcrVA4和AcrVA5,较低的浓度下对dCas12a TFs也能产生明显的抑制作用。此外,我们的结果还显示,两个或三个AcrVAs的共同表达不能增强对dCas12a TF的抑制作用,这表明不同AcrVA之间可能存在dCas12a竞争。最后,通过基因编辑实验数据,表明了AcrVA4可能会大大限制LbCas12a的基因编辑作用。总的来说,我们的结果表明,dCas12a:crRNA和AcrVA蛋白是酿酒酵母合成转录网络中的高性能组分。