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研究背景神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)是小儿最常见的恶性实体肿瘤之一,占儿童期肿瘤的8-10%,其恶性程度高,多数患儿最终愈后不良,故深入研究NB的发生、发展机理至关重要。我们课题组在对NB的发生、发展机理进行研究时发现：雌激素(estrogen, E)和环境雌激素双酚A(bisphenol A, BPA)均能促进神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株的增殖、侵袭和转移,即E和BPA均可促进NB的发展。在此基础上,我们试图探寻E和BPA对NB起始环节的作用,而肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)即属于肿瘤的起源细胞,故我们选择研究“E和BPA对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株的CSC的影响”来探寻“E和BPA对NB起始环节有无作用”。研究目的SP(side population, SP)分析法从神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株中分离并鉴定出CSC,明确E和BPA干预对SK-N-SH细胞株的CSC有无影响,最终了解E和BPA对NB的起始环节有无作用。材料与方法一、SK-N-SH细胞株侧群细胞的检测及检测条件的优化：不同的Hoechst孵育时间、不同的维拉帕米浓度检测SK-N-SH细胞株的SP细胞(侧群细胞)比例,根据SP细胞的检测效果选择各自的最佳条件；不同浓度Hoechst染色后的表型观察、CCK-8活细胞数评定了解Hoechst对SK-N-SH细胞株的毒性；不同浓度Hoechst染色后的流式细胞仪细胞周期分析、Annexin V-FITC和PI双标法流式细胞仪凋亡及死亡分析、再培养后SP细胞比例的检测,探讨Hoechst对SK-N-SH细胞株毒性的机理；最后对比不同浓度Hoechst对SK-N-SH细胞株的SP细胞检测效果,选择出能有效检测SP细胞并最低毒性的Hoechst浓度。二、SK-N-SH细胞株侧群细胞的分选及其干细胞特性的鉴定：流式细胞仪于SK-N-SH细胞株中分选出SP细胞和非SP细胞(NSP细胞)；SP和NSP细胞均分别接种于正常生长培养基和干细胞培养基中培养并传代,观察细胞表型的变化；电镜观察SP和NSP细胞的超微结构；免疫荧光和免疫印迹法了解SP和NSP细胞的干细胞和分化细胞标志物的表达；CCK-8分析了解SP和NSP细胞的增殖能力；连续培养的SP和NSP细胞的表型观察、蛋白标志物表达及流式细胞仪SP细胞比例再检测了解各细胞亚型的分化潜能；平板克隆实验、Transwell侵袭实验、裸鼠成瘤实验明确SP和NSP细胞的恶性程度。三、雌激素和双酚A对SK-N-SH细胞株侧群细胞作用的研究：E2和BPA干预后流式细胞仪检测SK-N-SH细胞株的SP细胞比例；E2和BPA干预后免疫印迹法检测干细胞标志物c-kit和ABCG2蛋白的表达；CCK-8分析和流式细胞周期分析确认E2和BPA对SK-N-SH细胞株的促增殖作用；CCK-8分析了解E2和BPA对SK-N-SH细胞株的SP和NSP细胞各亚型的促增殖作用。结果一、SK-N-SH细胞株侧群细胞的检测及检测条件的优化：60min的Hoechst孵育时间、50μmol/L的维拉帕米浓度可有效于SK-N-SH细胞株检测出SP细胞；SK-N-SH细胞株特异地对低浓度的Hoechst毒性反应敏感,其机理与Hoechst干扰细胞周期、诱导细胞死亡和凋亡有关；对比不同浓度Hoechst的检测效果和毒性,最终选择5μM的浓度用于SK-N-SH细胞株的SP细胞分选；以上述的检测条件检测出SK-N-SH细胞株的SP细胞比例为3.6±0.2%。二、SK-N-SH细胞株侧群细胞的分选及其干细胞特性的鉴定：成功于SK-N-SH细胞株中分选出SP和NSP细胞；SP细胞胞体小、有神经丝样突起,贴壁能力弱、集聚性生长,核质比高、胞浆细胞器少,高表达干细胞标志物、低表达分化细胞标志物,增殖速度快,具有快速分化能力,克隆形成能力强、侵袭性高、裸鼠成瘤率高；SK-N-SH细胞株的NSP细胞胞体大、无神经丝样突起,贴壁能力强、单层生长,核质比低、胞浆细胞器多,低表达干细胞标志物、高表达分化细胞标志物,增殖速度慢,具有缓慢的分化能力,克隆形成能力消失、侵袭性弱、无裸鼠成瘤能力。三、雌激素和双酚A对SK-N-SH细胞株侧群细胞作用的研究：E2和BPA均能使SK-N-SH细胞株的SP细胞比例下降直至检测不出、均能下调干细胞标志物c-kit和ABCG2蛋白的表达；E2和BPA均对SK-N-SH母细胞有显著的体外促增殖作用,但对其NSP细胞亚型的促殖作用较对其SP细胞亚型更显著。结论1.SP细胞研究时要警惕Hoechst的毒性,对任一将行SP细胞研究的新细胞株,SP细胞检测、分选的系列条件均应予优化以寻及最佳检测条件。2.SK-N-SH细胞株的SP细胞有CSC的特征。3.E2和BPA对SK-N-SH细胞株中具有干细胞特性的SP细胞的作用较对其NSP细胞小,故E2和BPA对NB的发生相对作用不大。