火棘果缓解化疗致小鼠血小板减少症的作用研究

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化疗药物对癌症患者产生严重的副作用,其中,化疗致血小板减少症(Chemotherapy-induced thrombocytopenia,CIT)是常见的并发症之一,CIT严重影响化疗进程、增加出血风险和缩短生存期。目前,CIT的治疗方法主要为血小板输注和药物治疗,存在价格昂贵及副作用强等弊端。服用具有一定疗效且安全性较高的天然植物及由其开发的功能食品是预防CIT的有效途径。火棘(Pyracantha fortuneana)的果实在我国食用历史悠久,且古医书中记载其具有健脾活血功效,而以传统健脾止血中草药开发的制剂已被临床应用于治疗血小板减少症,本课题前期预实验发现火棘果也具有提升血小板的作用,但关于其防治CIT的作用目前尚未有研究报道。为了探究火棘果这一功效,促进火棘果资源开发利用,本课题从功效评价、有效组分确定及其作用机制分析等方面深入研究了火棘果缓解小鼠CIT的作用,取得如下研究结果:(1)构建了CIT小鼠模型,发现火棘果及其醇提物对CIT具有缓解作用。首先,通过比较皮下和腹腔两种方式注射环磷酰胺,确定腹腔注射构建CIT小鼠模型效果更佳;其次,利用该动物模型探究不同剂量火棘果果粉膳食(PFP)和火棘果醇提物(PFE)对CIT小鼠血小板计数、体重、体征的影响,发现两种方式干预下,血小板减少症均得到有效缓解,其中,PFE高剂量组在实验第21天血小板计数达到(892.10±108.64)×10~3/μL,是模型组的1.51倍(P<0.05),相比PFP组,PFE提升血小板数的作用更为明显,表明醇提物PFE具有更好的缓解CIT作用。(2)研究发现乙酸乙酯提取组分(PFEEA)为PFE中缓解CIT的有效组分,该组分在提升血小板计数的同时,改善止血效果,减少骨髓抑制和脏器损伤。依次用不同极性的溶剂对PFE进行萃取分离,分别得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的组分。动物实验结果显示,各组分干预下,相比模型组,仅PFEEA组小鼠血小板计数显著提升(P<0.01),在实验第25天达到(1425±86.24)×10~3/μL,表明PFEEA为有效组分。进一步试验发现,该组小鼠出血时间、凝血时间及出血量降低(P<0.05),表明PFEEA改善止血效果;同时,骨髓和脾脏H&E染色切片发现,PFEEA作用下CIT小鼠骨髓抑制得到缓解,脾脏损伤得到修复,而且血清中谷丙转氨酶水平显著降低,表明PFEEA缓解了CIT小鼠脏器形态及其功能的损伤。对PFEEA进行分析,其总黄酮和总多酚含量分别为327.71±17.08 mg/g DW、132.84±1.54 mg/g DW,与PFE相比,富集了5.69倍、5.44倍。利用HPLC标准品比对以及LC-HR-MS/MS分析研究,确定了PFEEA中含有芦丁等9种多酚类化合物,其中绿原酸、金丝桃苷和异槲皮苷富集倍数较高,可作为PFE开发功能食品等健康产品的质控参考指标。(3)利用小鼠骨髓细胞转录组分析和细胞因子检测,探究PFEEA缓解CIT的作用机制,发现PFEEA通过上调血小板生成通路相关基因和细胞因子来发挥作用。转录组分析表明,PFEEA显著上调H2-Aa、Itgb3、Cd36、Itga2b、Gp5、Itga4等基因,这些基因主要富集在巨核细胞、血小板等生成通路,证实PFEEA促进巨核细胞和下游血小板的生成。此外,采用ELISA试剂盒检测血小板生成通路中重要的细胞因子血小板生成素(TPO)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量发现,相比于模型组,PFEEA组小鼠血清TPO、GM-CSF含量分别降低42.5%、55.9%,且肝脏TPO m RNA表达量提高35.14%,表明PFEEA通过促进TPO在肝脏中的生成,并加速血清中TPO、GM-CSF的摄取利用,从而达到缓解CIT的作用。综上,火棘果醇提物对CIT具有明显的缓解作用,其有效部位是乙酸乙酯提取组分,可通过上调血小板生成通路相关基因和细胞因子来发挥缓解CIT的作用,因而具有开发缓解CIT的功能食品和特医食品的潜力。
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