成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGFs)超家族在人和小鼠中共包括22个基因。FGFs通过其受体FGFRs发挥着包括早期胚胎和器官发育等在内的众多生命进程。FGF2又称基础FGF,是FGF超家族成员之一。研究显示FGF2在血管形成和损伤修复中作为一个增生因子而存在,同时越来越多的研究表明FGF2能够作为一个促癌蛋白从而调控肿瘤的发生发展。在人的黑色素瘤中FGF2和FGFR1呈现显著高表达,并且在黑色素瘤细胞体外成瘤试验中,抑制FGF2或者FGFR1的表达能够显著抑制肿瘤的生长。FGF2-FGFR1信号通路的高表达也是小细胞肺癌和胶质瘤等的重要发病诱因。先前的研究表明在超过94%的胶质瘤患者中FGF2 m RNA水平的表达显著上调并且高表达的FGF2能够增加胶质瘤的恶性程度。另外研究提示FGF2具有抗凋亡的特性能够通过上调一些抗凋亡的基因,例如BCL-2和B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因(B-cell lymphoma/Leukemia-xl,BCL-XL)导致肿瘤细胞的耐药性。在人体中,FGF2有五个亚型(18,22,22.5,24 and 34 k Da),分别由FGF2的m RNA选择性翻译而产生。分子量大小为18KDa的FGF2(18K-FGF2)是从经典的Kozak AUG密码子开始翻译的,它包含了155个氨基酸并且是FGF2的核心区域。剩余的四个亚型被称作高分子量的FGF2(HMW-FGF2),它们是选择性由CUG密码子转录翻译的。之前的研究显示,HMW-FGF2主要定位在核内,而18K-FGF2则定位在胞浆,并且核内的HMW-FGF2与胶质瘤细胞的增殖能力密切相关。然而,有关不同亚型的FGF2在细胞中分布不同的机制仍然不甚明了。在我们的研究中,我们不仅探讨了HMW-FGF2入核的机制而且证实了核内的HMW-FGF2对胶质瘤细胞系T98G的增殖和存活具有重要影响。HMW-FGF2的入核与核转运蛋白karyopherin家族成员Kapβ2密切相关。同时我们发现HMW-FGF2的入核还与调控Kapβ2-入核复合物的Ran GTPase密切相关,与18K-FGF2过表达组相比,HMW-FGF2过表达能够显著促进胶质瘤细胞系T98G的增殖能力。总体说来,我们的研究首次发现Kapβ2和Ran GTPase调控HWM-FGF2入核的分子机制,并揭示出了该分子机制在胶质瘤的细胞增殖中发挥的重要作用。第一部分18k-FGF2和HMW-FGF2的核定位检测目的:为了探究18k-FGF2和HMW-FGF2在胶质瘤细胞系中的定位,我们构建了18K-FGF2和HMW-FGF2的过表达质粒,并将其转染至胶质瘤细胞系T98G中以探究FGF2在胶质瘤中的定位。方法:质粒构建:将FGF2的c DNA序列(NCBI编号:2247)作为PCR反应的目的模板,使用以下引物扩增HMW-FGF2:正向引物:5’-CCC AGA TCT ATG TAC CCA TAT GAT GTT CCA GAT TAC GCT CTG GGG GAC CGC GGG CGC GGC CGC-3’反向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’使用如下引物扩增18K-FGF2:正向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’反向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’应用Bgl II和Xba I进行酶切并将上述扩增的目的片段克隆到p CMV2载体中。得到的N端HA修饰的HMW-FGF2的氨基酸序列如下:YPYDVPDYA-LGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTA APRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPK RLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVC ANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYV ALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS得到的N端修饰的18K-FGF2的氨基酸序列如下:YPYDVPDYA-MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGG FFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMK EDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQY KLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS细胞培养:人胶质瘤细胞系T98G购自美国ATCC。细胞使用含10%胎牛血清MEM-α培养基进行培养,并置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。培养基中无FGF2和EGF的添加。免疫荧光:将T98G细胞接种在玻片上然后转染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后,用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。核浆分离:将T98G细胞用p H为7.4包含5m M磷酸钠、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m MKCl、2m M二硫苏糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解,同时将裂解产物刮取下来。加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中,而下层为细胞核提取物。蛋白免疫印迹:将细胞用PBS清洗并用添加蛋白抑制剂的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100和2m M PMSF)进行裂解。蛋白浓度用BCA法进行测量和定量。使用25μg总蛋白进行蛋白电泳。结果:我们成功的构建了18K-FGF2和HMW-FGF2 HA修饰的过表达质粒,并通过测序和蛋白免疫印迹检验成功。使用HA抗体进行免疫荧光结果显示HMW-FGF2主要定位于细胞核中,而18K-FGF2则定位在胞浆中。尽管HWM-FGF2有三个区别较为明显的亚型(22,24,34k Da),然而结果只显示了一种条带较为清楚的FGF2,这是由于N端修饰的HA标签阻遏了从CTGs起始的HMW-FGF2的翻译。这种的特殊的表达方式消除了实验误差以及提供了较好的实验条件。通过蛋白免疫印迹分析分别转染HWM或18K-FGF2的细胞核浆分离产生的蛋白,结果显示几乎所有过表的18K-FGF2都定位在细胞浆中,而HMW-FGF2主要定位在细胞核中,只有少量存在细胞浆中。结论:1在胶质瘤细胞中HMW-FGF2主要定位在细胞核中。2 18K-FGF2主要定位在细胞浆中。第二部分kapβ2介导的FGF2入核机制目的:包含核定位序列(NLSs)的蛋白的核浆转运往往受到Kapβ的调控,为了探究Kapβ是否参与了包含NLSs序列的HMW-FGF2的入核,我们将HA-HMW,HA-18K和空载质粒转染进T98G细胞中并使用蛋白免疫共沉淀分析Kapβ2和FGF2的结合关系。为了探究Kapβ2是HMW-FGF2的核定位所必须的,我们使用了两种不同的Kapβ2 m RNA干扰序列进行沉默Kapβ2的表达,并使用蛋白免疫共沉淀法进行检验;同时使用核浆分离检测干扰Kapβ2后对FGF2在胞浆和核中的定位。由于FGF2信号通路调控了包括细胞增殖在内的多个生物学功能,接着我们探究了FGF2与Kapβ2是否对T98G增殖有影响。方法:RNA干扰:Kapβ2RNA干扰核苷酸由Dharmacon公司合成。将T98G细胞培养在无血清培养基中并用Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)进行脂质体转染,转染48小时后进行后续检测。定量PCR检测:使用Trizol(Invitrogen,USA)提取RNA,并使用Promega.SYBR green试剂盒(Thermo Scientific,USA)进行逆转录并进行实时定量PCR检测。基因的表达量用以2-ΔΔCt法进行分析并用GAPDH进行标准化。蛋白免疫共沉淀:转染FGF2的细胞用PBS清洗几遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。将裂解的蛋白用BCA试剂盒进行定量。按照抗体说明书使用HA抗体结合目的蛋白并在4℃过夜。使用A/G凝胶将HA抗体复合物洗脱下来并离心,在95℃加热变性。将制备的蛋白样品用蛋白免疫印迹进行检测。免疫荧光:将T98G细胞接种在玻片上然后转染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。核浆分离:将T98G细胞用p H为7.4包含5m M磷酸钠、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m M KCl、2m M二硫苏糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解,同时将裂解产物刮取下来,加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中,而下层为细胞核提取物。MTT分析:为了检测细胞增殖,按照说明书使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Roche,Switzerland)进行检测。将T98G细胞用0.5mg/ml MTT处理并在含5%O2的37℃培养箱中培养,接着使用裂解缓冲液孵育过夜,并在570nm吸收光下进行检测。统计分析:所有结果取自至少五次独立结果,并使用mean±SEM标准化后展示。处理组与对照组的差异使用t检验进行分析,当p<0.05时表示具有明显差异。结果:使用Kapβ2干扰能够实现80%左右的干扰效率并且能够显著抑制Kapβ2的m RNA水平和蛋白水平。使用免疫荧光染色显示干扰Kapβ2等能够抑制核浆转运,并且导致HMW-FGF2的亚细胞分布。对免疫荧光进行统计分析结果显示,HMW-FGF2转染组和对照组相比,核与浆中FGF2的比值为85%和15%,而干扰Kapβ2后则与对照组相比无显著差异,比值分别为50%和49%。核浆分离结果与蛋白免疫荧光结果类似,Kapβ2干扰后HMW-FGF2在核内的表达水平显著下降。细胞增殖实验显示尽管HWM-FGF2和18K-FGF2过表达都能促进细胞增殖,然而HWM-FGF2过表达促进增殖效果更为明显。HWM-FGF2组在Kapβ2干扰后能够显著抑制其增殖能力,而18K-FGF2过表达组则没有明显变化。结论:1 HMW-FGF2的入核依赖于Kapβ2。2 HMW-FGF2能够通过Kapβ2入核促进T98G增殖。第三部分FGF2入核依赖于Ran GTPase目的:研究显示Kapβ2搬运复合物的核浆转运活性依赖于Ran GTPase核苷酸循环。为了确认Ran GTPase在Kapβ2-HMW-FGF2核转运的重要性,我们使用了GTPγS和GDPβS处理细胞。GTPγS是无水解酶活性的GTP的类似物,可以使Ran保持在GTP的结合位置。GDPβS也是一种无水解酶活性的GDP的类似物,并能使Ran保持在与GDP结合的位置。为了探究Ran GTPase对Kapβ2-HMW-FGF2促进细胞增殖的作用,我们使用GTPγS和GDPβS处理细胞,从而探究Ran GTPase对T98G细胞增殖的影响。方法:GDPβS和GTPγS处理:使用HA-HMW-FGF2转染T98G细胞,在转染后将培养基换成含0.1n M GTPγS、GDPβs或者无菌水作为对照。将细胞放置在37℃进行培养并进行后续细胞提取、核浆分离以及MTT分析。免疫荧光:将T98G细胞接种在玻片上然后转染HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后,用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后,用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。核浆分离:将T98G细胞用p H为7.4,包含5m M磷酸钠、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m M KCl、2m M二硫苏糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解,同时将裂解产物刮取下来。加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中,而下层为细胞核提取物。蛋白免疫共沉淀:转染FGF2的细胞用PBS清洗几遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。将裂解的蛋白用BCA试剂盒进行定量。按照抗体说明书使用HA抗体结合目的蛋白并在4℃过夜。使用A/G凝胶将HA抗体复合物洗脱下来,离心后95℃加热变性,制备完成上样样品。将制备的蛋白样品用蛋白免疫印迹进行检测。MTT分析:为了检测T98G细胞增殖,按照说明书使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Roche,Switzerland)进行检测。将T98G细胞用0.5 mg/ml MTT处理并在含5%O2的37℃培养箱中培养,接着使用裂解缓冲液孵育过夜,并在570nm吸收光下进行检测。统计分析:所有结果取自至少五次独立结果,并使用mean±SEM标准化后展示。处理组与对照组的差异使用t检验进行分析,当p<0.05时表示具有明显差异。结果:使用HA进行免疫荧光结果显示GTPγS和GDPβS处理后都能够显著阻断HMW-FGF2过表达的T98G细胞中的HMW-FGF2的核聚集。使用蛋白免疫印迹分析核浆分离结果显示,HMW-FGF2过表达的T98G细胞中抑制Ran GTPase活性也能够阻断HMW-FGF2的核转录。蛋白免疫共沉淀结果显示只有GDPβS处理后能够使HMW-FGF2与Ran结合。细胞增殖结果与干扰Kapβ2结果类似;使用GTPγS和GDPβS抑制Ran GTPase的活性以及FGF2核转录后,能够显著降低HMW-FGF2导致的T98G细胞的过度增殖。结论:1 HMW-FGF2入核依赖于Ran GTPase。2 Ran GDP与FGF2结合调控FGF2的浆-核转运。第四部分FGF2入核激活Akt信号通路目的:为了探讨FGF2对细胞增殖促进作用的机制,我们探究了细胞内主要的调控通路PI3K/AKT信号通路的变化。为了探究是HMW-FGF2入核而不是18K-FGF2对FGF2促进PI3K/AKT信号的作用,我们构建了包含NLSs序列的18K-FGF2质粒并转染入T98G细胞从而探究其功能。方法:免疫荧光:将T98G细胞接种在玻片上然后转染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。核浆分离:将T98G细胞用p H为7.4包含5m M磷酸钠、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m MKCl、2m M二硫苏糖醇、1m M Mg Cl2、0.5 m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解,同时将裂解产物刮取下来。加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中,而下层为细胞核提取物。蛋白免疫共沉淀:转染FGF2的细胞用PBS清洗几遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。将裂解的蛋白用BCA试剂盒进行定量。按照抗体说明书使用HA抗体结合目的蛋白并在4℃过夜。使用A/G凝胶将HA抗体复合物洗脱下来,离心后95℃加热变性,制备完成蛋白样品。将制备的蛋白样品用蛋白免疫印迹进行检测。MTT分析:为了检测T98G细胞增殖,按照说明书使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Roche,Switzerland)进行检测。将T98G细胞用0.5mg/ml MTT处理并在含5%O2的37℃培养箱中培养,接着使用裂解缓冲液孵育过夜,并在570nm吸收光下进行检测。统计分析:所有结果取自至少五次独立结果,并使用mean±SEM标准化后展示。处理组与对照组的差异使用t检验进行分析,当p<0.05时表示具有明显差异。结果:过表达18K-FGF2和HMW-FGF2都能够下调PTEN的表达,但是HMW-FGF2下调效果更为明显。过表达FGF2后能够上调p-Akt表达水平,这显示FGF2可能是通过下游的PTEN/p-Akt信号通路发挥促进细胞增殖的作用,同时在HMW-FGF2过表达的T98G细胞中干扰Kapβ2能够抑制p-Akt表达水平。而18K-FGF2添加NLS序列修饰后能够促进其进行入核,并且细胞增殖显示18K-NLS-FGF2过表达的T98G细胞增殖速率明显高于其他FGF2过表达的细胞系,特别是HMW-FGF2。蛋白免疫印迹结果显示18K-NLS-FGF2过表达能够显著抑制PTEN表达并能够提高p-Akt的表达。结论:1核内的HMW-FGF2能够活化p-Akt信号通路。2 NLS序列在HMW-FGF2入核中起了关键作用。