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微生物污染无处不在,在食品的生产、加工以及贮存、运输等流程中都有被污染的可能性。食品安全检测指标规定了菌落总数、霉菌和酵母等计数方法,但该法存在操作过程步骤较长、结果滞后等缺点,无法适应现代高通量快速检测的需求。为弥补现行食品安全检测的缺陷,建立一种快速检测鉴定食品中微生物污染的方法,本研究根据细菌、酵母、霉菌的保守基因序列,分别设计出通用型探针和引物,建立了运用实时荧光PCR法检测的反应体系和反应条件,进而对该方法进行特异性验证、灵敏度分析及稳定性评价,并应用于产品样本的检测。同时对模板DNA提取进行优化,以便提高检测速度,降低实验成本。通过裂解液和煮沸、液氮研磨等方法相结合,建立了适用于PCR技术的细菌和真菌DNA快速提取法,并对提取液浓度进行优化,通过灵敏度、重复性以及应用于样品微生物DNA的提取等方式验证该法的有效性。提取液浓度优化结果显示,细菌的提取液最佳浓度为Triton-X 100 4%和Tween-20 0.5%,而真菌提取液最佳浓度为浓度氯化苄40%和SDS 1%。灵敏度实验细菌选用革兰氏阳性菌单增李斯特菌、革兰氏阴性菌沙门氏菌作为目标菌,真菌选用酿酒酵母和黄曲霉菌作为目标菌,结果表明,该法具有高灵敏度,对沙门氏菌检出限为460 cfu/m L,对单增李斯特菌的检出限为540 cfu/m L,对酿酒酵母的检出限在580 cfu/m L,对黄曲霉检出限在600 cfu/m L;重复性验证结果表明,该法稳定性好,对细菌代表菌株沙门氏菌组内CV在0.58-1.15%之间波动,组间CV在0.27-0.87%之间波动,对真菌代表菌株黄霉菌组内CV在0.45-1.57%之间波动,组间CV在0.78-0.99%之间波动;并成功应用于钙片混合颗粒等微溶性样品微生物DNA的提取。根据细菌保守基因序列16S r RNA基因设计出细菌通用型引物探针,建立实时荧光定量PCR检测法,并通过特异性、灵敏度、稳定性以及人工污染样品的验证。细菌通用型引物探针的检测结果表明该引物探针对细菌的检测有高度特异性,31种细菌等目标菌检测结果均为阳性,而10种酵母菌和6种霉菌等非目标菌均为阴性;灵敏度实验选用的革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌灵敏度达550 cfu/m L,革兰氏阴性的大肠杆菌O157灵敏度达420 cfu/m L;稳定性验证结果表明大肠杆菌O157组内实验CV在0.56-1.03%之间波动,而组间实验CV在0.54-1.01%之间波动,金黄色葡萄球菌组内实验CV在0.75-1.09%之间波动,组间实验CV在0.58-1.29%之间波动,该法稳定性都良好;人工污染样品检测结果显示,当感染菌为大肠杆菌O157时,浓度为5 cfu/25 g的样品在培养8 h后检出阳性,浓度为10 cfu/25 g、15 cfu/25 g的样品在培养6 h后检出阳性。当感染菌为金黄色葡萄球菌时,浓度为5 cfu/25 g、10 cfu/25 g的样品在培养8 h后检出阳性,浓度为15 cfu/25 g的样品在培养6 h后检出阳性。分别根据酵母保守基因序列26S r RNA基因和霉菌保守基因序列28S r RNA基因,设计出酵母通用型引物探针和霉菌通用型引物探针,通过已知酵母和霉菌分别对设计的通用型引物探针进行特异性、灵敏度、稳定性以及人工污染样品的验证。确定建立的酵母通用型引物探针对酵母菌的检测有高度特异性,在选定的菌株范围内,荧光PCR检测结果的特异性为100%;高灵敏度,检出限在570 cfu/m L;稳定性好,组内实验CV在0.62-0.81%之间波动,而组间实验在0.43-0.77%之间波动。确定建立的霉菌通用型引物探针对霉菌的检测有高度特异性,在选定的菌株范围内,荧光PCR检测结果的特异性为100%;高灵敏度,检出限在620 cfu/m L;稳定性好,组内实验CV在0.75-1.03%之间波动,而组间实验在0.68-1.13%之间波动。人工感染样品结果表明毕赤酵母和米曲霉浓度为5 cfu/25 g、10 cfu/25 g的样品在时间段10 h均未能检出,在12 h后均检出阳性,而20 cfu/25 g的样品在10 h时两种菌都检出阳性。综上所述,本研究所构建的实时荧光定量PCR探针法方法具有操作简单、快速、特异性强、灵敏性高、稳定性好等优点,为检测食品安指标提供了新的检测手段。