论文部分内容阅读
人类基因几乎都有多个内含子，外显子常可以一种以上方式连接，产生多种mRNA分子，编码不同的蛋白质，这个过程称为可变剪接。通过可变剪接，可以由一个基因产生多种转录子，编码一系列功能相近或相反的蛋白质并影响细胞的生物学功能。 人的CYP2D家族由CYP2D6基因和4种假基因CYP2D7P1、2(又称为CYP2D7AP、CYP2D7BP)及CYP2D8P1和2(又称为CYP2D8AP、CYP2D8BP)组成。已报道的CYP2D mRNA有6种可变剪接，变异体a保留了整个内含子5；变异体b保留了整个内含子6；变异体b′缺失了外显子6的3′末端91 bp；变异体c缺失外显子6；变异体d保留了内含子6的3′末端57 bp；变异体e保留了内含子6的3′末端部分，缺失了外显子6的3′末端91 bp。 CYP2C亚家族由CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18和CYP2C19四个成员组成。CYP2C18 mRNA主要在人表皮细胞中表达，在人表皮细胞中发现有几种可变剪接：遗漏外显子5，外显子4，外显子4、5、6，或遗漏外显子4、5、6、7。 为了研究CYP2D6和CYP2C18的代谢功能，用RT-PCR技术从中国汉族人的肝癌旁组织中克隆人CYP2D6和CYP2C18 cDNA，在测序鉴定时，发现了一种新的CYP2D6前mRNA的可变剪接，进一步在其它肝癌旁组织中用RT-PCR技术鉴定了另两种可变剪接。也在肝癌旁组织中发现了一个缺失外显子5的CYP2C18的剪接变异体，并对其代谢的影响进行了研究。细胞色素 P450 2D6和 ZC18的可变剪接研究 诸葛坚第一部分 三种新的CYPZD6前mRNA可变剪接鉴定二方法：人肝癌旁组织中R下＊＊R克隆C YPYP二＊6＊＊＊A，与po＊＊1载体进接，构建了重组体pGEM－CYPZD6，。并对所克隆的CDNA片段测序。用跨第1到第4外显于的一对引物，RTPCR分析门例中国汉族人肝癌旁组织的 CYPZD6第 1 到 4外显于的转录，对几个较短RTPCR产物测序。再用跨第1到第4外显子的引物扩增基因组DNA及测序鉴定。2结果：用扩增 CIPZD6 cDNA全长的一对引物所得的 RTPCR产物，琼脂糖凝胶电泳分析，在一肝组织中扩增到比全长 1．57 kb短的 1．Ikb片段。将此片段与 pGEM＊载体连接，构建了 pGEM－CyPZD6重组体。并对 CYPZD6 CDNA序列测定，与野生刑的 CYPZD6。DNA序列相比，较短的 CDNA从 79到 548缺火了 470核百酸，即第 1外显于门 80 hP）的 3’末端的 102 hp、第 2，第三外显于和第 4外显子（I6！hp）的 5末端的 43 hp被遗漏了。另外还有门 个碱基的替换和一个碱基插入和缺火：620A、G，7 ZG＋T，11 96T＋G，］40、C，1405C－G，1408A－G，1410T－C，1432C－T，1433A－－＋C，1435G－C，1440 insQ 1442T－－＋C，1443T、A，1449Cdel，1457G－C。这个cDNA在第96个密码子处提前出现终止密码于。此变异体命名为变异体 f。用卜肌动蛋白 CDNA作为内对照，用 CYPZD6 F ＄1） CYPZD6 4R引物 RTPCR分析了门例人肝癌旁组织中 CYPZD6第 1到第 4外显于的转录，4例肝组织同时有全长和较短的mRNA表达，5例仅有全K mRNA表达，8例仅表达短的mRNA。RTPCR扩增的CYPZD6第1到第4外显于片段，比预期全长的cDNA短的有两种，约300加和550加。将它们回收纯化，分别测序，与＊YPZp6 C＊＊A序列相比，300加K的片段缺失了第175到585位核昔酸，即有4if核昔酸（第58位到194位的137个氨基酸残基）被遗漏，也就是在第 1外显于（180 hp）的 3’末端 6七p，外显子2，外显子 3，以及外显子 4（161 hp）的 5’末端的 sl hp被遗漏了。通过对 RTPCR产物的直接测序，发现这种变异体在 4个不同个体的肝癌旁组织中出现，将这砖变异体命名为g。550 bgK的 浙江大学俗士学位诀文4细胞色素 P450 2D6和 ZC18的可变剪接研究 诸葛坚片段是缺失整个第三外显于的 153 hp，编码的蛋白将缺失引个氨基酸，同时还有 2个碱基对的替换：100 C－T和 336 C － T，导致编码的一个氨基酸替换 Pro34Ser，另一个不变，将此变异命名为变异体卜。提取曾经扩增到 CyPZD6 CDNA第】到第 4外显子全长、较短和两者同时都有表达的肝组织的基因组 DNA各 3、2、3例，仍用 CyPZD6 F和 CYPZD6 4R引物 PCR扩增。结果这些肝组织 DNA扩增产物均有外显于 1到 4全 K 2 kb的 CYPZD6 DNA产物，并无基因缺失的 300 hp条带。对来自于只有短的 RTPCR产物的肝组织的基因组DNA的 PCR产物部分测序发现，一个在第门 19（核昔酸 100）C＋T，第 3外显于 DNA序列第328o（核耷酸序列第408）0、C，编码的氨基酸不变门6 VaVa】，内含于2上DNA序列第3056G、C。另一个在DNA序列第！719（核昔酸100）C、T，内含于 1上的 1958T、C，山含子2上的3056口＋C。而DNA序列第门19（即核昔酸mo）C、T是中国人最常见等位基因型CYPZD6＊10的特征，在第1和第4外显子上未见突变。结论：鉴定了二种CYPZD6前mRNA的可变剪按。CYPZD6前mRNA的可变剪按在肝癌旁组织中出现很常见。它们不是由于基冈组DNA的突变或缺失引起，可能是剪接有关的调控蛋白的改变引起的。预期这三种可变剪接都会使CYPZD6 的活性卜降，