论文部分内容阅读
背景与目的: 淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤（Hodgkins Lymphoma，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s Lymphoma，NHL）。NK/T细胞淋巴瘤（Natural killer/T-cell lymphoma，NKTCL）是非霍奇金淋巴瘤的一种亚型，主要累及鼻腔、鼻窦及口咽区，并且与EB病毒密切相关。NKTCL在临床上具有侵袭性高、对化疗不敏感、预后差等特点。但其细胞起源以及生物学特性目前尚不清楚，这些机制的探讨可能为临床治疗NKTCL提供潜在靶点。 肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）是肿瘤细胞中的极小的亚群（通常所占比例不到1%），且被认为是一群能够自我更新，通过不对称细胞分裂产生祖细胞并保留分化潜能的细胞亚群。常规化疗药物只能对大部分肿瘤细胞有效，而对于被认为是维持肿瘤的基本细胞群体的CSC来说，往往具有抗性，进而导致肿瘤复发及侵袭能力的增强。大量的研究表明表征CSC的重要生物学分子可能成为新型抗肿瘤治疗的理想靶点。 侧群（side population cells，SP）细胞是由Goodell在分离骨髓干细胞时发现，位于多数细胞一侧的少量细胞，并具有自我更新、多项分化、无限增殖等干细胞样特性。目前已经在多种肿瘤组织中发现了侧群细胞，并且证实部分淋巴瘤中存在干细胞样特性的侧群细胞，但尚未有 NKTCL 相关方面的研究报道。我们前期的研究证实 NKTCL 细胞株 SNK-6 中存在阿霉素耐药的SP 细胞（SNK-6/ADM-SP），同时显著表达干细胞相关基因Nanog，但关于Nanog基因对这部分侧群细胞的作用机制尚不清楚。因此本课题选择 Nanog 基因为目标基因，构建携带Nanog mRNA编码区全长cDNA序列和shRNA序列的慢病毒表达载体来研究Nanog对NKTCL侧群细胞SNK-6/ADM-SP增殖、凋亡、迁移、克隆能力等恶性生物学行为的影响，说明Nanog基因对NKTCL的SP细胞的生物学影响，可能为NKTCL的治疗提供新的靶点。 第一部分：Nanog慢病毒载体的构建及转染 目的： 通过重组慢病毒表达载体，构建稳定过表达及沉默 Nanog 基因的NK/T 细胞淋巴瘤侧群 (Natural killer/T-cell lymphoma-side population，NKTCL-SP)细胞亚株。 材料与方法： 利用慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP (DCE)作为载体，链接Nanog克隆模板PCR产物，形成高表达慢病毒载体DCE-Nanog。设计并合成两条Nanog基因的shRNA，以干扰慢病毒pMAGic7.1为载体，构建Nanog基因干扰质粒 pMAG-Nanog-shRNA1、pMAG-Nanog-shRNA2。对过表达及沉默表达Nanog基因的重组质粒进行包装、病毒收集及滴度鉴定，Lipo6000TM转染淋巴瘤细胞，测定感染效率。Real-Time PCR及Western Blot筛选最有效的干扰序列。 结果： 酶切及测序结果显示过表达Nanog重组慢病毒质粒DCE-Nanog及沉默表达Nanog重组慢病毒质粒pMAG-Nanog-shRNA1、pMAG-Nanog-shRNA2构建成功。质粒包装后，收集的病毒滴度可达109IFU/ml。各质粒转染SNK-6/ADM-SP细胞系后分别命名为SNK-6/ADM-SP-con（空载体亚株）、SNK-6/ADM-SP-N（过表达亚株）、SNK-6/ADM-SP-shN1（沉默表达亚株）和SNK-6/ADM-SP-shN2（沉默表达亚株）。Real-Time PCR及Western Blot检测结果示SNK-6/ADM-SP-shN2组干扰效果最好，选择并命名为SNK-6/ADM-SP-shN进行第二部分实验。Westen Blot方法检测Nanog蛋白相对表达量，显示SNK-6/ADM-SP-shN组Nanog表达量 最 低 ，SNK-6/ADM-SP-N 组 表 达 量 最 高 ，SNK-6/ADM-SP 及SNK-6/ADM-SP-con组表达量无明显差异。 结论： 成功构建稳定过表达及沉默Nanog的NKTCL-SP细胞亚株。 第二部分：Nanog基因对SNK-6/ADM-SP细胞生物学特性的研究 目的： 探讨Nanog基因对NKTCL-SP细胞生物学特性的影响。 方法： 1. 采用CCK-8法测定Nanog基因对SNK-6/ADM-SP的增殖能力的影响； 2. 流式细胞术（FCM）测定Nanog对SNK-6/ADM-SP周期和凋亡的影响； 3. Transwell实验测定Nanog基因对SNK-6/ADM-SP迁移能力的影响； 4. 甲基纤维素克隆形成实验测定 Nanog基因对 SNK-6/ADM-SP的克隆形成能力的影响。 结果： 1. CCK-8实验结果显示：SNK-6/ADM-SP组和SNK-6/ADM-SP-con组增殖能力无明显差异（P＞0.05），SNK-6/ADM-SP-N组增殖能力明显增强（P＜0.05），SNK-6/ADM-SP-shN组增殖能力明显减弱（P＜0.01）。 2. FCM结果显示：SNK-6/ADM-SP组和SNK-6/ADM-SP-con组各周期比例无明显差异（P＞0.05），且凋亡比例无明显差异（P＞0.05）；SNK-6/ADM-SP-N组G0/G1期细胞比例明显减少（P＜0.05），S期细胞比例明显增高（P＜0.01），同时凋亡比例明显降低（P＜0.01）；SNK-6/ADM-SP-shN组G0/G1期细胞比例明显增高（P＜0.01），S期比例明显减少（P＜0.01），同其凋亡率增加（P＜0.01）。 3. SNK-6/ADM-SP组和SNK-6/ADM-SP-con组迁移能力无明显差异（P＞0.05），SNK-6/ADM-SP-N组迁移能力明显增强（P＜0.01），SNK-6/ADM-SP-shN组迁移能力明显减弱（P＜0.01）。 4. 甲基纤维素克隆形成实验显示：SNK-6/ADM-SP 组和 SNK-6/ADM-SP-con组克隆能力无明显差异（P＞0.05），SNK-6/ADM-SP-N组克隆能力明显增强（P＜0.05），SNK-6/ADM-SP-shN组克隆能力明显减弱（P＜0.05）。 结论： 1. SP细胞是NKTCL中具有特殊生物学特性的细胞，其高表达的Nanog基因与NKTCL的恶性生物学特性相关。 2. Nanog基因可促进NKTCL-SP细胞SNK-6/ADM-SP的增殖、迁移和细胞周期进程，并增强细胞克隆形成能力。