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共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是一组天然存在的具有18个碳原子,含有共轭双键的多不饱和脂肪酸,是亚油酸(linoleic acid,LA)的位置和几何异构体。许多研究发现,CLA有抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、抗糖尿病、提高机体免疫力、增加骨密度、减少体脂等多种生理功能。其中CLA减少体脂的作用受到研究者的广泛关注。但是一些研究发现,CLA在减少体内脂肪的同时,肝脏中出现脂质沉积的现象,导致肝脏肿大;也有研究发现肝脏脂肪分解代谢增加,肝脏脂肪减少,其确切的分子机制尚不明确。丝氨酸/苏氨酸激酶-蛋白激酶B(PKB/Akt)是高等真核生物细胞中关键的信号节点。在细胞因子、生长因子的作用下,PKB/Akt作为磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)活化后的下游靶点,在细胞代谢、细胞存活、细胞周期调控、转录调控等多种生物学过程中发挥着重要作用。PI3K-PKB/Akt信号通路是胰岛素调节代谢作用的重要信号路径,可以调节细胞中脂肪代谢及糖代谢过程。因此,我们推测CLA对肝细胞脂质代谢的作用和PI3K-PKB/Akt信号通路有关。本实验以HepG2细胞为研究对象,通过观察细胞脂质沉积、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA表达、Akt、p-Akt、AMPK、p-AMPK蛋白的表达情况,研究CLA影响肝脏脂质代谢的可能机制。通过PI3K抑制剂LY294002干预细胞,进一步研究PI3K-PKB/Akt信号通路在CLA影响HepG2细胞脂质代谢中的作用。实验方法体外培养HepG2细胞,以不同浓度CLA(10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)作用细胞24小时,胰岛素溶液(100nmol/L)干预1小时后,比色法测定培养液中游离脂肪酸的含量;采用油红O染色方法观察细胞中脂质沉积情况;RT-PCR方法检测乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA表达水平;Western-blot方法检测细胞中p-Akt、Akt、p-AMPK、AMPK蛋白的表达情况。通过PI3K的抑制剂LY294002预处理抑制Akt蛋白磷酸化水平后,进一步观察CLA对HepG2细胞脂质沉积的影响。实验结果1) CLA增加HepG2细胞中脂质沉积:与对照组相比,50μmol/L、100μmol/L CLA组,细胞中红染脂滴明显增多。2) CLA作用HepG2细胞后培养液中游离脂肪酸降低:与对照组相比,50μmol/L、100μmol/L CLA组的培养液中游离脂肪酸的含量分别降低了25%、50 %(P﹤0.05)。3) CLA增加HepG2细胞ACC mRNA的表达:与对照组相比,ACC mRNA表达水平随CLA浓度增加而逐渐增高。相对于胰岛素对照组,50μmol/L CLA组和100μmol/L CLA组ACC的mRNA表达水平增高明显,分别增加了1.38倍、1.53倍。4) CLA增加Akt磷酸化水平:与胰岛素对照组相比,50μmol/L CLA组和100μmol/L CLA组,Akt的磷酸化水平明显增高,其中50μmol/L CLA组Akt磷酸化水平增加了1.98倍,100μmol/L CLA组Akt磷酸化水平增加了2.31倍(n=3,P﹤0.05)。5) CLA降低AMPK蛋白磷酸化水平:随着CLA作用浓度的升高, AMPK的磷酸化水平逐渐下降。相对于胰岛素对照组,50μmol/L CLA组和100μmol/L CLA组, AMPK的磷酸化水平下降显著(n=3,P﹤0.05),10μmol/L CLA组没有显著差异。6) CLA干预时,用LY294002预处理抑制Akt磷酸化后,细胞内脂质沉积量减少,油红O染色脂滴明显减少;细胞外游离脂肪酸增多,ACC的mRNA表达水平降低。实验结论从本实验得知,CLA增加了HepG2细胞的脂质沉积。在对其分子机理的研究中发现,CLA可以显著增加Akt蛋白的磷酸化水平,改变细胞中ACC的mRNA表达,抑制AMPK蛋白的磷酸化水平,提示与CLA对肝脏脂质沉积的影响有关;通过PI3K抑制剂LY294002抑制Akt蛋白的磷酸化水平之后,可以逆转HepG2细胞中脂质沉积水平和ACC mRNA的表达。提示PI3K-PKB/Akt信号通路与CLA诱导的细胞内脂质沉积密切相关。但是,肝脏脂肪代谢是一个复杂的网络调节过程,CLA是如何调节PI3K-PKB/Akt信号通路及是否存在其他影响机制,还需要进一步的深入研究。