研究背景心肌声学造影(Myocardial Contrast Echocardiography, MCE)是一种可以从微循环水平评价心肌血流灌注的新技术。近年无创性的心肌声学造影取得了突破性进展,可用于增强左室内膜边界识别、检测心肌梗死区及缺血区范围、测定冠脉血流储备、评价心肌存活性等。但是,超声微泡的惰性空化所带来的生物学效应的存在,始终令国内外学者担心其安全性。“空化”是指液体中的“气体空穴”在足够强的超声波照射下形成、长大、破裂的过程。在低声场中,微泡节律、对称地膨胀和压缩,称为“稳定空化”或者“非惰性空化”；在高声场中,微泡的膨胀和压缩变得不对称,且膨胀、压缩幅度显著增大,最终导致微泡破裂,这种现象称为“惰性空化”。惰性空化伴随着大量的能量释放,是其引起生物学效应的主要原因。2004年EMEA(欧洲药品评估署)鉴于三例与造影剂相关的死亡事件,暂时撤销了Sonovue在心脏疾病的诊断应用；2007年四例与造影剂似乎相关的死亡事件又一次引起了人们对声学造影安全性的关注。尽管大量的试验研究及临床回顾研究表明诊断条件下的造影基本是安全的,但是死亡病例似乎多发生于重症心脏患者,故美国药品监督管理局(FDA)于2007年发出关于心脏超声造影安全性的警告：禁止将心脏超声造影用于急性心肌梗死等重症心、肺疾患病人。该举措导致了超声造影界的一场轩然大波。被检者所处疾病状态果真是声学造影安全性的重要影响因素吗?心脏声学造影安全性是否还受到超声造影成像模式、超声造影剂种类的影响?以上问题均未见文献报到。为此,我们相对系统地观察超声造影对心肌毛细血管通透性的影响,探讨不同造影模式、不同造影剂、不同病理状态下超声造影所带来的生物学效应大小是否相同,以期为临床心肌声学造影的安全应用提供重要参考。第一部分超声造影对心肌毛细血管通透性影响的研究目的研究高机械指数、高剂量微泡造影剂条件下,超声造影对心肌毛细血管通透性的影响并观察其恢复正常的时间。方法将30只Wistar雄性大鼠随机分为5组。A-D组采用相同的超声造影条件,但各组伊文思蓝(EB)注射时间不同：分别为超声造影前10秒(A组)、造影结束即刻(B组)、造影结束后5分钟(C组)、造影结束后20分钟给予EB(D组)；E组为对照组(假造影组),即5分钟的超声照射结束后即刻再注射造影剂微泡及EB。造影方案采用高机械指数1.5,R波1：6心电触发,造影持续时间5分钟,所有动物均在EB注射后5分钟处死。记录造影前后大鼠心率及造影前后3分组心律失常数目,测定心脏EB渗出面积百分比及单位心肌内EB含量。另取两只大鼠,造影方案同前,均于造影前1分钟注射EB,造影结束即刻和造影结束20分钟分别取心脏,迅速切取超声照射区(EB外溢区),行透射电镜检查观察其病理改变。结果A、B、C组EB渗出面积百分比显著高于对照组(P<0.05),D组渗出面积百分比与对照组无显著性差异(P>0.05)；A、B组心肌EB含量显著高于对照组(P<0.05),C及D组心肌EB含量与对照组无显著性差异(P>0.05)。各组造影前后心率及心律失常数目无显著性差异(P>0.05)。透射电镜结果显示造影结束即刻与造影结束20分钟均可见毛细血管无扩张充血及出血,毛细血管内皮细胞无肿胀及断裂,周围心肌纤维排列整齐、规则,Z线完整、清晰,线粒体嵴清晰,无明显肿胀及空泡变性。第二部分造影模式、造影剂及疾病状态对心肌声学造影安全性影响的研究目的研究造影模式、造影剂及疾病状态对心肌声学造影安全性的影响方法1、不同造影模式对心肌声学造影安全性的影响,拟从两方面进行评估。1.1间断触发成像(IT)与低机械指数实时成像(RE)的安全性比较间断触发成像采用机械指数1.5,T波1：6心电触发成像,低机械指数实时成像采用低机械指数0.2实时成像,高机械指数1.3破坏微泡(a flash)。1.1.1将成年雄性Wistar大鼠随机分为全氟显间断触发成像(intermittent trigger imaging)组(IT)及其对照组(ITN)；全氟显低机械指数实时成像(real time imaging)组(RE)及其对照组(RN)。超声造影组的造影时间均为5分钟；对照组在超声照射5分钟后移开探头,之后再注射超声造影剂。实验过程中记录全部大鼠在造影前、后心率,以及造影前、后各3分钟内心律失常数目。1.1.2心肌EB渗出量、EB渗出面积百分比测定：各研究组动物在超声造影前1分钟经静脉注射EB (50mg/Kg),造影剂量均为5×108个微泡/kg,每次实验前用库尔特计数仪测定其浓度,弹丸注射,造影结束5分钟处死动物,分别测定心脏EB渗出面积百分比及单位心肌EB含量。1.1.3心肌肌钙蛋白测定：IT组及RL组另设一组不接受EB注射,均在造影前及造影结束后6h分别取血,分离血清检测心肌肌钙蛋白T (cTnT)。1.1.4 IT组及RL组各另取一只大鼠于造影结束10分钟迅速取心脏,IT组取EB外溢区行透射电镜镜检查。RL组大鼠在探头对应心脏位置取心肌组织,行透射电镜检查。1.1.5以心肌EB渗出量、EB渗出面积百分比、心肌肌钙蛋白T以及造影前后心率、心律失常变化情况及其病理变化为指标,评价间断触发成像、低机械指数实时成像对大鼠心肌声学造影安全性影响的差异。1.2实时成像过程中,不同能量的微泡破坏(microbubble destruction)程序对安全性的影响1.2.1实时成像过程中,需要一次高机械指数的脉冲(a flash)破坏微泡,利用微泡的再充填速率来评价心肌的血流灌注速度。我们拟比较高MI破坏实时成像(RH)与低MI破坏实时成像(RL)安全性的不同。两种成像均采用低机械0.2实时成像,除flash的机械指数不同以外,余成像程序均一致。高MI破坏采用机械指数1.9破坏微泡,低机械指数破坏采用机械指数1.3破坏微泡。1.2.2将成年雄性Wistar大鼠随机分为RH组与RL组,RH组心肌EB渗出量、EB渗出面积百分比以及造影前后心率、心律失常变化情况及其病理变化检测同“间断触发成像(IT)与低机械指数实时成像(RL)的安全性比较”部分,以上面指标来评价高MI破坏实时成像与低MI破坏实时成像对大鼠心肌声学造影安全性影响的差异。2、不同造影剂对心肌声学造影安全性的影响2.1成年雄性Wistar大鼠随机分为声诺维(Sonovue)间断触发成像组(S)及其对照组(SN)；全氟显间断触发成像组(IT)及其对照组(ITN),造影模式方案采用间断触发成像(采用机械指数1.5,T波1：6心电触发成像),声诺维造影剂剂量采用库尔特计数仪计数和全氟显等同微泡数量(5×108个微泡/kg)。2.2心肌EB渗出量、EB渗出面积百分比、心肌肌钙蛋白T及心率、心律失常指标及病理检测测定方法与“间断触发成像与低机械指数实时成像对心肌声学造影安全性影响研究”部分相同。比较全氟显及声诺维对大鼠心肌声学造影安全性影响的差异。3、不同疾病状态对心肌声学造影安全性的影响3.1模型制作：慢性高脂血症大鼠模型制作：3月龄雄性Wistar大鼠经高脂饲养2个月制备,以血脂及超敏CRP测定结果判定模型是否成功。急性心肌缺血再灌注大鼠模型制作：麻醉后气管插管,连接呼吸机,开胸,于左心耳下方2mm结扎前降支30分钟后再灌注两个小时。3.2成年雄性Wistar大鼠随机分为正常大鼠全氟显间断触发成像组(IT)及对照组(ITN)；慢性高脂血症大鼠随机分为间断触发成像组(C)及对照组(CN)；急性心肌缺血再灌注大鼠(myocardial ischemia reperfusion)亦随机分为间断触发成像组(Ⅰ)及对照组(IN)。3.3超声造影方案均采取间断触发成像,机械指数1.5,T波1：6心电触发成像,QFX剂量5×108个微泡/kg弹丸注射。对照组均采用相同能量超声照射5分钟移开探头,注射微泡。3.4心肌EB渗出量、EB渗出面积百分比测定：各研究组动物在超声造影前1分钟经静脉注射EB (50mg/Kg),实验过程中记录全部大鼠在造影前、后心率,以及造影前、后各3分钟内心律失常数目。造影结束5分钟处死动物,分别测定心脏EB渗出面积百分比及单位心肌EB含量。3.5心肌肌钙蛋白测定：由于急性缺血再灌注模型基础cTnT可能会有升高,造影后6h其浓度也在不断升高。故以假造影组(单纯超声照射5分钟后移开探头再注射超声微泡)作为对照,在超声照射后6h抽血测定肌钙蛋白,比较超声造影对心肌缺血再灌注组肌钙蛋白的影响。即：造影组与对照组均在造影前及造影后6h抽血测定cTnT。3.6以心肌EB渗出量、EB渗出面积百分比、心肌肌钙蛋白T以及造影前后心率、心律失常变化情况为指标,比较不同疾病状态对大鼠心肌声学造影安全性影响的差异。结果1、不同造影模式对心肌声学造影安全性的影响1.1间断触发成像与低机械指数实时成像的安全性比较间断触发成像组(IT组)心肌EB含量及EB渗出面积百分比均显著高于其对照组(P值均<0.05)；低机械指数实时成像组(RL组)造影后心肌EB含量及EB渗出面积百分比与其对照组无显著差异(P>0.05)。IT及RL组造影前后cTnT无显著性差异(P>0.05)；各组造影前后心率及心律失常数目无显著性差异(P>0.05)。IT组透射电镜观察可见毛细血管无明显扩张充血及出血,毛细血管内皮细胞未见明显肿胀及断裂,线粒体嵴清晰,心肌纤维排列整齐、规则,Z线完整、清晰,线粒体嵴清晰,无明显肿胀及空泡变性。RL组透射电镜观察未见明显毛细血管扩张充血及出血,血管内皮细胞未见明显肿胀,线粒体嵴清晰,心肌纤维排列整齐、规则,Z线完整、清晰,线粒体嵴清晰,无明显肿胀及空泡变性。1.2实时成像过程中,不同能量的微泡破坏(microbubble destruction)程序对安全性的影响RH组心肌EB含量及EB渗出面积百分比明显高于RL组(P值均<0.05),两组造影前后心率及心律失常数目无显著性差异(P>0.05)。RH组大鼠透射电镜观察可见毛细血管无明显扩张充血及出血,血管内可见中性粒细胞及红细胞,血管内皮细胞未见明显肿胀,线粒体嵴清晰,心肌纤维排列整齐、规则,Z线完整、清晰,线粒体嵴清晰,无明显肿胀及空泡变性。RL组大鼠心肌组织透射电镜观察未见明显毛细血管扩张充血及出血,血管内皮细胞未见明显肿胀,线粒体嵴清晰,心肌纤维排列整齐、规则,Z线完整、清晰,线粒体嵴清晰,无明显肿胀及空泡变性。2、不同造影剂对心肌声学造影安全性的影响全氟显组(IT组)及声诺维组(S组)在造影前后心率及心律失常数目均无显著性差异(P>0.05)。两种造影剂组在造影前后cTnT (P>0.05)均无显著性差异。两种造影剂组在造影后心肌EB含量及EB渗出面积百分比均显著高于各自对照组(P<0.05)；造影后心肌EB含量及EB渗出面积百分比变化在两种造影组之间无显著性差异(P>0.05)。IT组透射电镜观察可见毛细血管无明显扩张充血及出血,毛细血管内皮细胞未见明显肿胀及断裂,线粒体嵴清晰,心肌纤维排列整齐、规则,Z线完整、清晰,线粒体嵴清晰,无明显肿胀及空泡变性。S组透射电镜观察可见毛细血管无明显扩张充血及出血,毛细血管内皮细胞未见明显肿胀及断裂,线粒体嵴清晰,心肌纤维排列整齐、规则,Z线完整、清晰,线粒体嵴清晰,无明显肿胀及空泡变性。3、不同疾病状态对心肌声学造影安全性的影响正常大鼠、慢性高脂血症大鼠、急性缺血再灌注损伤大鼠在造影后均见心肌EB含量及EB渗出面积百分比显著高于各自对照组(P<0.05)；三种大鼠EB渗出面积百分比较各自对照组的增加值无显著性差异,心肌缺血再灌注损伤造影组大鼠EB含量较对照组的增加值显著高于正常大鼠与慢性高脂血症组较各自对照组的增加值(P<0.05),但心肌EB含量较各自对照组的增长率在三组之间则无差异(P>0.05)。正常大鼠及慢性高脂血症大鼠在超声造影前后cTnT、心率及心律失常数目均未见显著改变(P>0.05)。缺血再灌注损伤大鼠造影组和其对照组比较,以造影前cTnT为协变量,造影后cTnT无显著性差异(P>0.05)。慢性高脂血症组心肌EB渗出含量与其超敏CRP水平无显著性相关关系(x2=1.847,P>0.05)。结论1、高机械指数超声联合高剂量微泡造影剂可使心肌毛细血管通透性增加,但这种通透性变化为一过性的,其恢复时间在超声造影结束后20分钟内。2、高机械指数间断触发成像与低机械指数实时成像模式对大鼠心率、心律失常数目、肌钙蛋白水平及心肌超微结构均无明显影响。与低机械指数实时成像比较,高机械指数间断触发成像所致心肌声学造影后毛细血管通透性升高更为明显。提示两种超声造影模式中低机械指数实时成像模式是更为安全的造影模式。为了超声造影安全,造影过程中应当首选低机械指数实时成像模式。3、同为低机械指数实时成像,但微泡破坏程序的机械指数不同,亦存在一定的安全性差异。其中,高MI破坏组心肌EB含量及EB渗出面积百分比较均明显高于低MI破坏组。两组对大鼠心率、心律失常数目无影响,病理检查无明显异常改变。提示实时成像过程中,微泡破坏程序的能量设置也是影响其安全性的一个重要因素。4、在间断触发成像模式下,脂质造影剂“声诺维”与蛋白外壳造影剂“全氟显”对于正常大鼠的心肌声学造影安全性的影响是相似的。5、慢性高脂血症大鼠及急性心肌缺血再灌注大鼠在心肌声学造影造影前后安全性指标与正常大鼠未见不同。提示疾病状态对大鼠心肌声学造影的安全性影响是相似的。