论文部分内容阅读
受体酪氨酸激酶是机体信号转导通路的重要调节因子,在胚胎生长、发育,新陈代谢和细胞凋亡等多种生理过程中发挥关键作用。当正常细胞的酪氨酸激酶代谢调节发生紊乱,或控制编码酪氨酸激酶的基因发生基因突变,过表达以及自分泌和旁分泌刺激时,会诱发机体产生癌症、炎症、糖尿病等多种疾病。目前受体酪氨酸激酶已经成为多种疾病特别是癌症治疗领域的研究热点,是癌症治疗的重要药物靶标之一。c-Met激酶属于受体酪氨酸激酶的一个亚家族,目前的研究发现,在肺癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌等多种癌症中c-Met高表达,其已成为抗癌药物发现的重要靶标。小分子化合物芯片(SMMs)技术是指将化合物库中大量的小分子化合物固定于二维基质表面,例如玻片表面,得到空间地址可读的和微型化的化合物阵列的技术。小分子化合物芯片技术目前主要应用于以下领域,例如鉴定一些蛋白的配基、用于先导化合物的筛选及作用机制研究、研究大分子和配基的相互作用以及用于酶的功能研究等。本论文工作的研究目的是利用小分子化合物芯片(SMMs)技术,初步建立c-Met蛋白激酶与小分子化合物相互作用关系的研究平台。主要关注点在于初步探索利用小分子化合物芯片研究c-Met蛋白激酶与小分子化合物相互作用关系的有效性评价,为以后利用SMMs技术进行c-Met蛋白激酶和小分子化合物相互作用研究打下基础。本文研究工作及结果主要包括如下方面:1.根据已知的c-Met激酶与其吲哚酮类小分子抑制剂SU11274的晶体复合物结构信息,即SU11274的哌嗪环不参与c-Met激酶活性的抑制信息,设计合成了用于偶联于SMMs的活性异氰酸酯表面的SU11274类似物T9b-T9f共五个。化合物T9b-T9f的结构经1H-NMR和ESI-MS确证。2.运用生物化学的方法对化合物T9b-T9f进行组织来源和重组来源的c-Met激酶抑制活性评价。结果表明,利用组织来源的受体酪氨酸激酶抑制剂进行活性评价,抑酶作用化合物T9e和T9d分别达68%和79%,强于阳性化合物SU11274。抑酶作用强弱顺序分别为:T9d >T9e >T9b >T9f > SU11274 >T9c。利用重组来源的c-Met酪氨酸激酶时,五个化合物的抑酶作用均弱于SU11274,抑酶作用强弱顺序分别为:SU11274 >T9e >T9d >T9b >T9f > T9c。两种评价结果表明,五个化合物的抑酶强弱顺序基本一致。结果提示T9b、T9d、T9e和T9f四个合成的化合物可能是非特异性酶抑制剂,其作用可能涉及其他酪氨酸激酶;而SU11274是特异c-Met酶抑制剂。3.将五个化合物固定于玻片表面制成小分子化合物芯片,并运用SMMs技术进行c-Met蛋白激酶和小分子化合物相互作用研究。结果显示,合成的SU11274类似物化合物T9b-T9f在偶联至异氰酸酯活性表面后,随着点制在活性玻片上的化合物浓度逐步降低,荧光值也随之降低,说明芯片测定的荧光值和化合物浓度之间存在依赖性关系。同时化合物T9b-T9f在相同浓度时,不同的化合物之间对应的荧光值也不同。五个化合物浓度均在100 mM时,芯片测定的荧光值强弱次序为:T9d >T9e >T9f >T9c >T9b。五个化合物浓度均在50 mM时,芯片测定的荧光值强弱次序为:T9f >T9d >T9e >T9c >T9b。SMMs方法测定的化合物T9d、T9e和T9f分别与c-Met酪氨酸激酶KD大小顺序为T9e >T9f >T9d,说明此三个化合物与c-Met激酶的结合能力强弱顺序为T9d >T9f >T9e。与生化实验结果对比,化合物T9f与c-Met激酶的结合能力经SMMs方法测定的相对强,在化合物T9b-T9f中只低于T9d,而在生化实验方法评价T9b-T9f对c-Met的抑制活性时,重组来源和组织来源的c-Met实验结果都表明T9f和T9c的抑制活性较弱,这可能是由于T9f偶联于固相表面后,化合物结构倾向于某种有利于与c-Met激酶结合的构象所致,而T9c固定于固相表面时未有这种现象产生。对于化合物T9d和T9e与c-Met结合能力相对值,用SMMs方法测定的结果与生化实验结果有很好的一致性,而化合物T9b其SMMs方法测定的与c-Met结合的荧光值却明显降低,这可能是因为在T9b偶联于固相表面后,化合物空间伸展性受到限制所致。SMMs结果提示化合物T9d可以在以后的研究中作为阳性探针用于化合物SMMs通量筛选。同时结合分子对接结果即在固相表面的分子对接模拟T9f和c-Met激酶的结合模式,其与SU11274在自由状态时的结合模式相似,共同为以后SMMs技术的完善提供研究方向,可以尝试在异氰酸酯6个碳链的基础上再增加6个碳的连接臂,有可能消除化合物固定于固相表面的空间限制。4.进行了AUTODOCK Vina分子对接分析。表明化合物无论是在自由状态非玻片表面,还是固定在玻片表面时,每一种化合物与c-Met对接结合时,两种情况下的对接结合的模式并未发生改变。这对于利用SMMs方法进行化合物活性强弱评价的研究,提供了理论依据。