研究背景心室重构是心脏在多种形式的损伤因素作用下所产生的大小、形状、室壁厚度和组织结构等一系列变化,是病变修复和心室整体代偿及继发的病理生理反应过程。在心室重构中,多种炎症细胞因子和神经体液因子如血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ Ang Ⅱ)和内皮素(endothelin, ET)等的作用,使心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)通过分泌多种细胞因子与生长因子、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与降解失衡、增殖、迁移和表型转化等多种途径,参与病理性心室重构过程。临床上预防细胞增殖和心肌纤维化是阻止心室重构的关键。Ang Ⅱ刺激CFs还可分泌多种细胞因子,这些因子以旁分泌或自分泌的方式调控CFs自身和周围的心肌细胞代谢结构功能而参与心肌重构。AngⅡ受体有四种亚型,分别为AT1R、AT2R、AT3R和AT4R,目前认为Ang Ⅱ引起CFs产生的多种生物学效应主要由AT1R介导,临床上用AT1R受体拮抗剂防治高血压和心衰已取得较好的近期疗效。AT1R又分为两个亚型,即ATlaR和AT1bR。AT1受体为经典的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors, GPCRs),因此对G蛋白信号通路的调控是心肌重构潜在的治疗靶点。AT1通过Gq蛋白激活磷脂酶C(Phospholipase C, PLC),水解二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol4,5-bisphosphate, PIP2)产生三磷酸肌醇(1,4,5,-trisphosphate, IP3)和二酰基甘油(diacyl glycerol, DAG),促使内质网Ca2+库释放Ca2+,引起胞内游离Ca2+浓度瞬间增加,活化蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),介导PKC-依赖性酪氨酸激酶途径,刺激人CFs蛋白质合成过程。受体在受到连续的刺激后通常会出现脱敏的现象。P-arrestin与G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptor kinases, GRK)联合作用,通过介导受体脱敏和内吞,对大部分GPCRs信号转导通路具有重要的负调节作用。β-arrestin有β-arrestin1和2两个亚型,广泛的存在于各种细胞中。当GPCRs被激活后,β-arrestin转移到细胞膜,结合到被激动剂占领的受体上,促使这些受体与G蛋白分离,从而导致受体脱敏。活化的β-arrestin分子释放出C末端,与胞内小泡表面的网格蛋白(clathrin)结合,介导GPCRs的内吞。β-arrestin可以调节内吞后GPCRs的运输模式,在GPCRs循环中起到了特别的作用。近期研究表明,β-arrestin不仅仅是信号的终止子,还是GPCRs介导信号转导通路的支架蛋白,他还可以改变G蛋白介导的第二信使通路激活MAPK。除了调节GPCRs的脱敏和信号传递,β-arrestin1还可以进入细胞核内直接或间接影响一些转录因子,在基因表达调控上发挥更多的功能,P-arrestin介导的信号转导和转录调节是细胞生物学的新发现,也是治疗GPCRs功能失调疾病的新靶点。大鼠心梗后心衰模型的心肌β-arrestin-1mRNA和蛋白表达均升高,免疫组化检测提示β-arrestin-1可能是内皮功能的主要调节因子。肾上腺过表达β-arrestin-1促进心肌梗死后醛固酮水平的升高,从而加速心脏的有害再构并降低心室功能。体内抑制肾.上腺β-arrestin-1基因表达后可显著减少循环中醛固酮水平而阻止上述有害变化。AT1R拮抗剂氯沙坦不能降低β-arrestin-1升高的醛固酮水平。对心衰动物模型的研究提示,β1-肾上腺素受体和AT1R介导的β-arrestin依赖的EGFR/ERK信号活化对心脏起到了保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)是从绿茶中提取的一种单体成份,它是绿茶主要的活性和水溶性成份,是儿茶素中含量最高的组分,占绿茶毛重的9%-13%,具有潜在的抗炎、抗肿瘤等作用,同时对心脏的保护作用也受到关注。EGCG被认为介导一氧化氮引起的血管舒张,保护缺血再灌注心脏。同时研究发现EGCG可以有效地减轻压力负荷造成的大鼠心脏肥厚和重构,阻止心脏肥厚中的心肌细胞凋亡和氧化应激反应,抑制心肌成纤维细胞的异常增殖而改善心肌重构,组织病理学检查发现EGCG可有效的减轻左心室心肌纤维化程度。因此EGCG可能成为治疗患者心肌重构的有效药物。目前的研究多认为EGCG对于心肌保护主要通过抑制氧化应激,而没有EGCG对心肌成纤维细胞AngⅡ受体AT1R调节作用的报道。但在吗啡引起的身体依赖性研究中发现,EGCG可以适度降低蓝斑中吗啡升高的cAMP水平,抑制多巴胺受体2(一种GPCRs)信号通路,对吗啡引起的身体依赖性产生显著地药理作用。综上所述,现有证据表明EGCG对G蛋白信号通路有确定作用,目前的研究多认为EGCG的通过抑制氧化应激发挥心脏保护作用,但尚不清楚EGCG对心肌成纤维细胞AngⅡ受体AT1R是否具有调节作用,同时β-arrestin是GPCRs的重要调节分子。因此我们希望了解在心肌成纤维细胞异常活化过程中,AT1R的调节分子β-arrestin发挥了怎样的作用？EGCG是否通过调节P-arrestin影响AT1R而发挥抑制心肌成纤维细胞异常增殖的作用？本实验拟在体外用AngⅡ活化的新生大鼠心肌成纤维细胞为研究对象,采用小干扰RNA (small interfering RNAs, siRNA)、实时荧光定量RT-PCR (real-time quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)和western blot等手段,探讨β-arrestin在CFs中的表达和分布变化及其对AT1R信号的调控作用,以进一步揭示CFs活化和ECM合成的机制,同时观察EGCG对CFs β-arrestins表达和AT1R信号的影响,以进一步阐明其抑制心肌成纤维细胞增殖和活化的分子机制。研究目的1.分离培养新生大鼠心肌成纤维细胞,观察EGCG对正常CFs和血管紧张素Ⅱ异常活化CFs功能的影响。2.探讨EGCG对心肌成纤维细胞β-arrestin-1和β-arrestin-2表达的影响,揭示β-arrestin表达变化与细胞活性之间的相关性。3.阐明β-arrestin-1对心肌成纤维细胞AT1R表达、细胞活性、增殖和胶原合成能力的影响及EGCG的作用。4.揭示EGCG对血管紧张素Ⅱ受体AT1R-Gq-PKC信号通路的影响。研究方法1.新生大鼠心肌成纤维细胞的分离培养和鉴定取新生1-3天的Sprague-Dawley (SD)大鼠,在超净工作台上无菌取出心脏,分离心室肌组织,剪碎,用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化成单细胞悬液,去除非贴壁细胞,贴壁细胞继续培养。进行细胞爬片,冷丙酮固定后用免疫组化法检测培养细胞中波形蛋白(成纤维细胞中大量表达)的表达情况,染色阳性证实为心肌成纤维细胞。第2-4代细胞用于实验。2.体外给药分组细胞同步化后,用AngⅡ (1×10-7mol/L)体外作用CFs,设EGCG (1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol/L)五个给药组,用血管紧张素Ⅱ受体反向激动剂缬沙坦(valsartan, Val)(1×10-6mol/L)作为阳性对照给药,给药后培养24小时,并设正常CFs组。检测EGCG对正常CFs的影响设正常细胞组和EGCG (1×10-5mol/L)给药组。3.CFs细胞活力检测采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)法检测CFs的活力。同步化后体外用AngⅡ刺激或给予不同浓度EGCG处理后培养24h,终止培养前6h每孔加入MTT,弃去上清后每孔加入二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO),震荡30s后于酶标仪570nm处检测吸光度值。4.CFs细胞增殖能力和胶原合成量检测采用3H-TdR参入法检测CFs的增殖能力,3H-羟脯氨酸参入法检测胶原合成量。细胞同步化后体外用AngⅡ刺激或给予不同浓度EGCG处理后培养24h,终止培养前6h每孔加入3H-TdR或3H-羟脯氨酸,培养结束用胰酶消化细胞,用多头细胞收集仪收集细胞至玻璃纤维纸上,烘干后加入闪烁液溶解,以液体闪烁计数器测定每分钟的脉冲数cpm。5. RT-qPCR检测用Trizol法提取CFs,总RNA,经逆转录获得cDNA,以GAPDH为参照,通过RT-qPCR技术检测β-arrestin-1、AT1aR和AT1bR mRNA水平的表达。6. Western blot检测CFs中加入适量细胞裂解液,反复冻融破碎细胞,3000×g离心,提取上清即为细胞总蛋白,用Lowry法定量后加入上样缓冲液,煮沸,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE),经过分离、转膜、封闭、孵育一抗、二抗、显色等,分别检测细胞总β-arrestin-1、 β-arrestin-2、AT1R、Gq的表达水平。细胞总蛋白继续用37000×g离心,上清为胞浆蛋白,定量后用于检测细胞浆磷酸化PKC-delta的表达情况；沉淀用细胞裂解液溶解后定量,用于检测细胞膜β-arrestin-1、AT1R和磷酸化PKC-delta (p-PKC-delta)表达水平。采用广谱钙粘附素(pan cadherin)鉴定胞浆胞膜蛋白的分离效率。7.大鼠CFs β-arrestin-1的siRNA沉默用β-arrestin-1的siRNA干扰试剂盒干扰大鼠CFs中β-arrestin-1基因表达。设计3对干扰序列。CFs用不含抗生素的血清培养到70%以上融合,吸弃旧培养液,PBS洗涤,加不含抗生素、含5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM。将siRNA/Lipofectamin2000复合物,加到含有细胞和Opti-MEM培养基的6孔板中。孵育6h后,除去复合物,更换5%DMEM,再培养24h、48h、72h。荧光显微镜观察最佳转染时间,提取蛋白,进行Western Blot检测,确定最佳干扰序列和干扰效率。8.统计学分析所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析。数值变量资料数据以均数士标准差(x±s)表示,两组间均数比较采用小样本T检验,多组间差异显著性比较采用One-Way ANOVA方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.心肌成纤维细胞的培养情况用倒置显微镜观察,心肌成纤维细胞生长迅速,2-3天即呈汇合状态,细胞排列整齐紧密,有的交叉重叠生长。心肌成纤维细胞呈梭形,胞体较大,胞质透明；细胞核较大,呈椭圆形,通常含2-3个核,无自发性搏动。2.心肌成纤维细胞的鉴定用免疫组化法检测上述方法培养的第2代新生大鼠心脏细胞中波形蛋白表达情况,发现细胞波形蛋白染色呈强阳性,符合心肌成纤维样细胞的特征。3. EGCG对正常大鼠心肌成纤维细胞活力、增殖和胶原合成的影响EGCG对正常大鼠CFs的细胞活力、增殖和胶原合成能力均无显著影响(P>0.05)。说明EGCG对正常CFs没有抑制作用。4. EGCG对AngⅡ诱导的大鼠心肌成纤维细胞活力、增殖和胶原合成的影响MTT法检测发现,EGCG1×10-7-1×10-5mol/L浓度依赖性的抑制(?)AngⅡ诱导的CFs细胞活力(P<0.05或P<0.01),Val1×10-6mol/L也具有明显的抑制作用(P<0.01); AngⅡ作用24h后,细胞3H-TdR和3H-羟脯氨酸的参入量显著增多,EGCG1×10-7-1×10-5mol/L显著抑制AngⅡ作用下CFs的增殖能力(P<0.05或P<0.01), EGCG1×10-6-1×10-5mol/L明显减少活化CFs胶原的产生(P<0.05或P<0.01), Val均可以抑伟(?)AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原合成(P<0.01)。以上结果提示,EGCG体外对AngⅡ诱导的CFs异常活化、增殖和胶原合成有显著恢复作用。5. EGCG对AngⅡ作用下CFs p-arrestin-1和β-arrestin-2表达水平的影响与其对细胞活力影响的相关性分析AngⅡ作用下,CFs中P-arrestin-1mRNA的表达水平显著升高(P<0.01),EGCG1×10-6、1×10-5mol/L显著恢复β-arrestin-1mRNA水平(P<0.01)。然而,AngⅡ的刺激和EGCG体外给药均不能影响CFs中β-arrestin-2的蛋白表达水平(P>0.05)。上述研究结果证实,P-arrestin-1参与了AngⅡ诱导的CFs活化,而β-arrestin-2作用不明显,且β-arrestin-1也是EGCG发挥作用的分子靶点之一。将EGCG对AngⅡ诱导下CFs活力的影响和β-arrestin-1mRNA水平的影响进行相关性分析发现,二者存在显著地正相关(R2==0.9304,P=0.0019)。以上结果提示,EGCG对CFs活力的抑制作用与减少β-arrestin-1基因表达有关,β-arrestin-1在CFs的异常活化中可能起到促进作用。6.β-arrestin-1在AngⅡ诱导CFs AT1R表达、细胞活化、增殖和胶原合成中的作用及EGCG的影响为进一步确定β-arrestin-1在CFs活化中的作用,我们用siRNA沉默CFs中β-arrestin-1的表达,RT-qPCR和western blot法筛选出最佳干扰序列为Sense:5’-AG CCUUCUGUGCUGAGAACTT-3’, Anti-sense:5’-GUUCUCAGCACAGAAGGCUTT-3’,该序列可以减少56.7%的β-arrestin-1基因表达和55%的蛋白表达。与对照序列相比,在沉默了β-arrestin-1基因的CFs中加入AngⅡ培养24h,细胞膜AT1R分布明显增多(P<0.05),对细胞活力、细胞增殖能力和胶原合成能力的影响明显减小(分别为P<0.01、P<0.01和P<0.05)；EGCG1×10-5mol／L体外给药可以进一步升高AngⅡ作用下AT1R膜表达(P<0.05),抑制细胞的活力和增殖能力(P<0.05),但对胶原合成没有明显影响(P>0.05)。以上结果证明,β-arrestin-1调节AT1R内吞,是参与AngⅡ介导CFs活化过程的关键分子,也是EGCG发挥治疗作用的重要靶点。7. EGCG对Angll作用下CFs中AT1R、β-arrestin-1和Gq表达的影响在AngⅡ刺激下,CFs中AT1aR mRNA水平降低(P<0.05),EGCG1×10-5mol/L体外给药可以使其恢复到接近正常水平,但AT1bR mRNA水平没有明显变化,提不AngⅡ主要通过影响AT1aR发挥活化CFs的作用。进一步检测发现,AngⅡ诱导的CFs中β-arrestin-1总表达和胞膜表达均明显升高(P<0.01),而AT1R,总表达和胞膜表达均降低(P<0.01),Gq蛋白总表达减少(P<0.01)。EGCG1×10-5mol/L减少β-arrestin-1的总表达(P<0.05)；EGCG1×10-6和1×10-5mol/L不同程度减少β-arrestin-1的胞膜表达(P<0.01和P<0.05); EGCG1×10-6和1×10-5mol/L显著升高AT1R,总表达和胞膜表达；然而EGCG对Gq蛋白的表达减少没有恢复作用。8. EGCG对Angll作用下CFs中p-PKC-delta表达的影响与正常细胞相比,AngⅡ刺激CFs使细胞浆中p-PKC-delta表达明显减少,EGCG1×10-6和1×10-5mol/L体外给药显著升高降低的胞浆p-PKC-delta水平,但AngⅡ和EGCG均不能影响胞膜p-PKC-delta的表达。结论1.细胞形态学观察和免疫组化法共同证实用酶消化法分离心室肌组织得到的贴壁细胞为心肌成纤维细胞。2. EGCG体外给药对正常CFs的细胞活力、增殖和胶原合成能力没有影响,而对AngⅡ诱导下CFs的异常活化、增殖和胶原合成有显著抑制作用。3.β-arrestin-1是参与AngⅡ介导CFs活化过程的关键分子,β-arrestin-2未发挥明显作用。4. β-arrestin-1调节AT1R内吞,在CFs的异常活化中可能起到促进作用,EGCG对CFs活力的抑制作用与减少β-arrestin-1表达、抑制(?)ATIR内吞有关。5. AngⅡ主要通过影响AT1aR及其下游信号通路活化CFs, EGCG通过抑制β-arrestin-1总表达和胞膜表达,不同程度的恢复AT1R下游信号分子水平,发挥治疗作用。