背景与目的:胶质母细胞瘤是人类颅内恶性程度最高的肿瘤之一,有着易复发,难治愈的特点。而低氧状态是肿瘤的关键病理特征,主要由于肿瘤细胞生长速度快,与之相匹配的血管生成速度慢,局部组织的血液灌注出现障碍而导致局部低氧。胶质母细胞瘤由于生长速度快,常常导致中心区域血液供氧障碍,肿瘤组织形成坏死区。这其中低氧状态一直是胶质母细胞瘤中的普遍现象。近年来热点研究显示,低氧状态对恶性肿瘤的发生发展起到了调控作用,它在促进肿瘤进展,诸如侵袭,转移,血管增殖等方面,和肿瘤适应低氧应激环境方面都起到重要作用。目前已表明低氧状态下的关键调节蛋白是低氧诱导因子-1复合物(Hif-1 complex),此复合物是一个异质二聚体的转录因子,由低氧诱导因子-1α(Hif-1α)和低氧诱导因子-1β(Hif-1β)两个亚单位组成。常氧状态下,Hif-1α可被PHD蛋白羟基化后,经VHL蛋白识别而使Hif-1α泛素化,经由泛素-蛋白酶体系统快速降解,但低氧状态下,PHD蛋白受到抑制,导致Hif-1α在细胞中积累,并与Hif-1β二聚化结合,形成活化的Hif-1复合物,并由胞质转入胞核内,在胞核内结合于靶基因启动子区或增强子区上的低氧反应元件(HRE,5’-RCGTG-3’),从而激活下游靶基因的转录。同时近年来越来越多的研究表明lncRNA和人类胶质母细胞瘤的发生发展关系密切。一些lncRNA参与肿瘤低氧下的功能变化过程,在促肿瘤进展和适应低氧应激环境中都起到潜在作用。这其中lncRNA H19作为较早一批被发现的lncRNA,在许多肿瘤中都高表达,并与肿瘤的周期、侵袭、凋亡和增殖等活动密切相关。先前研究发现,低氧下H19表达有所增加,但具体机制不明。本文就旨在探讨低氧对H19调控的具体机制,通过转录因子Hif-1α直接调控和间接调控两种途径与H19启动子区结合,激活其DNA转录过程,使得胶质母细胞瘤中H19过表达,从而影响胶质瘤细胞的恶性功能表型。这项研究为H19作为胶质瘤诊断和治疗靶点提供了理论依据,并为当下热门的低氧下调控lncRNA的机制研究提供了参考,为肿瘤进展中的分子调控机制研究提供了一个新的启示和研究方向。研究方法:1 人胶质瘤mRNA的芯片表达数据以及患者的生存数据均下载于美国癌症基因组图谱数据库(TCGA)官网。2 LncRNA荧光定量PCR采用SYBR Green PCR反应体系和TaqMan反应体系。利用物理低氧方式建立不同低氧时间段的各种胶质瘤细胞系,利用荧光定量PCR技术检测H19在这些不同时间节点的细胞中表达情况。3 利用质粒或小干扰RNA建立过表达或低表达Hif-1α的胶质瘤U87和U251细胞系,利用荧光定量PCR技术检测H19在这些U87和U251细胞系中的相对表达量。另外,通过裸鼠原位成瘤模型验证体内试验中也存在Hif-1α对H19表达的调控作用。4 通过荧光定量PCR和Western blot实验验证各种细胞中PTEN状态对于低氧下H19表达上调的敏感性影响,以及PTEN通过影响低氧下Hif-1α稳定性参与到低氧调控H19的表达这一过程中。5 运用荧光定量PCR和Western blot实验验证22例人脑胶质瘤组织样本中Hif-1α与H19的相关性,以及PTEN对这种Hif-1α与H19的相关性的影响。用免疫组化和原位杂交技术检测正常组织和胶质瘤组织中Hif-1α与H19的表达差异。6 生物信息学预测、染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,荧光素酶报告实验、荧光定量PCR和Western blot实验验证Hif-1α对H19启动子区的靶向关系以及Hif-1α调控的SP1对H19启动子区的转录调控。7 取对数生长期的U87和U251细胞,通过体外划痕和Transwell实验检测H19对于低氧下胶质瘤细胞迁移侵袭生物学行为的变化。8 生物信息学预测,荧光素酶报告实验、荧光定量PCR和Western blot实验验证H19通过吸附miRNA-181d对β-catenin蛋白的影响。研究结果:1 低氧环境下在U87和U251细胞中,H19表达量随低氧时间的延长而逐步升高。同时低氧中过表达Hif-1α后,H19表达较对照组有所上升,而敲低Hif-1α表达后,H19在低氧环境中的上调较对照组明显降低。在裸鼠原位成瘤模型中,体内实验也验证了上调Hif-1α表达可以促H19的表达。2 在不同胶质瘤细胞系中,表达PTEN野生型的Ln229细胞系和原代培养的PG1细胞系,H19对于低氧刺激的表达上调不敏感;而在PTEN缺失或者突变表达的U87,U251,U118,U373细胞系和原代培养的PG2细胞中,低氧可以显著有效地促H19表达上调。而通过回复实验,则PTEN野生的Ln229细胞和PTEN缺失的U87细胞均有H19对低氧反应的改变。这与细胞中的PTEN影响Hif-1α蛋白稳定性有关。3 在人15例正常脑组织和22例胶质母瘤细胞组织中,Hif-1α与H19均在肿瘤组织中较正常组织高表达,它们的表达量互相呈正相关。而组织样本中的PTEN状态可以影响Hif-1α与H19之间的正相关程度。4 生物信息学、染色质免疫共沉淀实验,荧光素酶报告基因实验和western blot研究表明:Hif-1α可以与H19启动子区内的低氧反应元件序列HRE(5’-acgtg-3’)结合,从而促进H19的转录,但即便HRE序列全部突变情况下,荧光素酶仍然有变化,表明Hif-1α也可以通过其它途径影响H19的转录。5 SP1已被报道可被Hif-1α结合于SP1的启动子区,从而促进自身的转录。生物信息学、染色质免疫共沉淀实验,荧光素酶报告基因实验和western blot研究表明:SP1也可以作用于H19启动子区促进H19的转录。体外和体内实验均证实SP1可以调控H19表达,回复实验证明SP1是Hif-1α调控H19反应中不可缺少的中间一环。6 体外划痕和Transwell实验证明H19在低氧对胶质瘤细胞迁移侵袭功能中起到一定作用,同时H19也是低氧调控EMT相关蛋白的重要中介者。7 生物信息学预测和荧光素酶报告基因实验提示H19可吸附miRNA-181d来调控α-catenin蛋白翻译水平,从而参与到肿瘤相关恶性功能改变中来。研究结论:1 胶质母细胞瘤细胞中低氧状态可以影响H19的含量,主要是通过Hif-1α来调控H19的转录水平来实现。而肿瘤细胞的PTEN状态是低氧对于H19刺激上调的阻挠因素。2 Hif-1α可以自身直接结合于与H19启动子区,促进H19转录;也可以通过促进SP1蛋白水平表达升高,而SP1也可以结合于H19启动子区,促进其转录水平升高。3 胶质母细胞瘤中异常表达的H19,可以吸附miRNA-181d,减少miRNA-181d对β-catenin的翻译抑制作用,最终促进β-catenin蛋白水平上升,调控其相关EMT蛋白,有助于低氧状态下增强肿瘤迁移侵袭能力。