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脓毒症(sepsis)即感染引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),是创伤、烧伤、休克、感染等临床急危重症患者的严重并发症之一,也是诱发脓毒性休克(septic shock)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的重要原因,一直是危重病医学所面临的重大难题,疾病的死亡率高达50%以上。在过去10年中,脓毒症的发生率增加了91.3%,并还呈逐年上升的趋势。由于脓毒症来势凶猛,病情进展迅速,病死率高,是ICU患者最常见的死亡原因之一。目前,脓毒症导致各组织器官功能障碍的病理生理学机制还不十分明确,因此深入探索脓毒症的病理生理过程和发生机制,寻找新的治疗方法,对于降低脓毒性休克的病死率具有重要价值。肝细胞线粒体是能量代谢的重要场所,在维持肝脏正常生命活动中起着重要作用。肝细胞线粒体的双层膜结构参与呼吸链电子传递、三大营养物质代谢、血氨代谢和尿素合成等,是维持肝脏正常功能的重要细胞器,肝脏线粒体膜功能的损伤可最终导致肝细胞凋亡。本课题通过建立脓毒症及脓毒性休克的动物模型,观察线粒体膜功能的变化及线粒体超微结构的改变,分析脓毒症时肝细胞线粒体膜损伤的机制。这可能是脓毒症致肝脏功能障碍的重要启动环节,也可能是脓毒症诱发MODS的关键一环。目的:通过提取脓毒症兔实验动物模型的肝细胞线粒体,检测肝脏水肿程度、线粒体肿胀程度、线粒体膜电位和线粒体膜上的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)酶的变化,并观察肝细胞线粒体超微结构的改变,来探讨脓毒症对肝细胞线粒体功能影响的可能机制,为指导脓毒症的治疗提供新的思路。方法:将新西兰兔36只,随机分成3组:(1)正常对照组(n=12):通过兔耳缘静脉注射生理盐水;(2)脓毒症组(n=12):通过兔耳缘静脉注射大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)1mg·kg-1;(3)脓毒性休克组(n=12):通过兔耳缘静脉注射2mg·kg-1。各组动物均麻醉后分离出右侧颈总动脉,经颈总动脉插管并连接压力换能器,监测平均动脉压、心率、呼吸频率。当脓毒症组实验动物心率、呼吸增快20%,即达到脓毒症标准后即处死;脓毒性休克组动物平均动脉压下降20%以上,休克诊断成立后,立即处死实验动物,对照组相同时间一并处死。处死后立即取出实验动物的肝脏,留取电镜标本,并取一定量肝脏组织采用干湿法测定肝脏组织水肿程度。同时采用差速离心法迅速提取肝细胞线粒体超低温保存,后经比色法测定线粒体膜上的MDA值、ATP酶活力,使用流式细胞术检测线粒体肿胀程度及膜电位的变化。结果:1.脓毒症和脓毒性休克模型的建立实验动物在静脉注射LPS 1mg/kg后,其血压无明显变化,而心率和呼吸频率逐渐加快,升高超过20%以上确立为脓毒症模型;实验动物在静脉注射LPS 2mg/kg后,心率和呼吸频率升高超过20%以上,同时检测到平均动脉压下降20%以上时确立为脓毒性休克模型。2.脓毒症时肝脏出现水肿,脓毒性休克时水肿程度加剧肉眼观察见脓毒症组实验动物肝脏轻度水肿、颜色正常;脓毒性休克组动物肝脏肿大明显,颜色灰暗。肝脏水肿程度用干湿重法比较,以脓毒性休克组肝脏水肿程度最为显著,脓毒症组次之(P<0.05)。3.脓毒症组线粒体膜上MDA含量增大,脓毒性休克组更为显著脓毒症实验兔肝细胞线粒体膜上的MDA含量较对照组明显增加,而脓毒性休克组中此项指标含量上升更为明显,各组间有明显统计学差异(P<0.05)。4.脓毒症时线粒体膜的数种ATP的活性均下降,脓毒性休克组下降幅度更大检测肝细胞线粒体膜的Na+K+-ATP酶、Mg++-ATP酶、Ca++-ATP酶活性,脓毒症时均减低,且这种减低在脓毒性休克组动物中表现得更加明显,各指标组间变化有统计学差异(P<0.05)。5.脓毒症组线粒体超微结构出现改变,脓毒性休克组改变更明显电镜下脓毒症组实验动物肝细胞线粒体肿胀,基质浓缩,粗面内质网扩张;脓毒性休克组可见肝细胞线粒体肿胀,且线粒体脊呈气球样变,排列混乱,线粒体膜增厚,并伴有大量脂滴聚集,细胞边界模糊,粗面内质网结构严重紊乱甚至消失。6.脓毒症时肝细胞线粒体水肿、跨膜电位减小,脓毒性休克时变化更加明显应用流式细胞仪测得,脓毒症组实验动物反映肝细胞线粒体肿胀程度的前角散射(Forward Scatter, FSC)值增大,表示跨膜电位的侧角散射(Side Scatter, SSC)值减小。这种变化同样出现在脓毒性休克组,且该组变化较脓毒症组更加明显,两组间差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论:通过对LPS制备的兔脓毒症及脓毒性休克实验动物模型的实验研究,发现LPS可能通过使肝细胞线粒体膜脂质过氧化、抑制膜表面ATP酶活性、降低跨膜电位、改变膜的通透性,致使线粒体肿胀、变性、功能丧失直至最终凋亡,由此导致肝细胞功能障碍。以上研究结果为今后探明脓毒症的病理生理过程,探寻脓毒症致肝损伤的机制,寻求脓毒症致肝损伤新的预防和治疗手段提供研究基础和理论依据。