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第一部分 环磷酸腺苷效应元件结合蛋白小干扰RNA重组腺病毒的构建、包装与鉴定目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签针对环磷酸腺苷效应元件结合蛋白CREB(Cyclic-AMP Response Element Binding Protein)的小干扰RNA重组腺病毒载体。方法:本实验利用siRNA在线设计软件依照siRNA设计原则设计出CREB的siRNA核心序列,并依此合成CREB的siRNA双链片段。将此片段与经AgeI和EcoRI酶切的病毒载体穿梭质粒进行连接,其连接好的产物转化入大肠杆菌感受态细胞。经测序鉴定阳性克隆的大肠杆菌阳性菌落,证实CREB RNAi基因片段成功连入穿梭质粒并重组成为hU6-CREB-Ubi-EGFP。该穿梭质粒与辅助质粒pBHG lox △E1,3Cre共转染HEK293细胞,通过腺病毒AdMax包装系统Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组,产生重组腺病毒。终点稀释法测定病毒滴度。结果:经测序鉴定阳性克隆的大肠杆菌阳性菌落,证实CREB RNAi基因片段成功连入穿梭质粒并重组成为hU6-CREB-Ubi-EGFP;经扩增纯化后,测得Ad-CREB-RNAi-EGFP 滴度为 1.00×109PFU/ml。结论:本实验成功构建了携带EGFP标签针对小鼠CREB基因siRNA片段重组腺病毒Ad-CREB-RNAi-EGFP,经纯化后得到较高的滴度。据此,为进一步研究CREB对视网膜新生血管性疾病的作用极其机制提供了实验工具。第二部分 环磷酸腺苷效应元件结合蛋白CREB在氧诱导视网膜病变小鼠模型的表达研究目的:通过氧环境的变化诱导小鼠视网膜新生血管,建立氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型。在此基础上探讨CREB蛋白在视网膜新生血管形成过程中的表达情况及意义。方法:将170只7日龄C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组和OIR模型组。正常对照组小鼠在正常氧环境下饲养,OIR模型组小鼠建立氧诱导视网膜病变模型。取两组中17日龄小鼠眼球制作视网膜铺片,行全视网膜血管荧光染色,观察视网膜血管的变化;取两组中17日龄小鼠眼球行石蜡包埋后制作视网膜H&E染色病理切片,并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目。分别取各组12日龄、14日龄、17日龄、19日龄、21日龄小鼠视网膜,蛋白质免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测各组小鼠各时间点视网膜钙结合蛋白CREB的蛋白表达量和mRNA表达量。结果:全视网膜铺片血管荧光染色结果显示在OIR模型组小鼠视网膜中有大量新生血管生成,其结构和分布紊乱;H&E染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目,OIR模型组显著高于正常对照组(P<0.05)。Western blot和Real-Time PCR结果显示OIR模型组CREB蛋白及mRNA表达量显著高于正常对照组。在OIR模型组中,从12d-17d,CREB的蛋白和mRNA表达量逐渐升高,从17d-21d,CREB的蛋白和mRNA表达量逐渐下降,含量变化差异具有统计学意义(P<0.05)。正常对照组中,随时间推移CREB的表达量无明显变化。结论:在OIR小鼠模型中,CREB的表达随视网膜新生血管的增殖过程趋势一致,CREB有可能是促视网膜新生血管因子。第三部分 环磷酸腺苷效应元件结合蛋白CREB基因静默对氧诱导小鼠视网膜新生血管的抑制作用目的:将CREB小干扰RNA重组腺病毒注射到OIR小鼠玻璃体腔内,沉默其CREB基因的表达,从而探索在CREB基因沉默后,OIR小鼠视网膜新生血管的变化。方法:将138只7日龄C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、基因治疗组、单纯模型组、空白载体组。正常对照组小鼠:与哺乳母鼠一起在常氧环境下饲养。基因治疗组:建立OIR模型,在12日龄时双眼玻璃体腔注射浓度为1.0×109 PFU/ml的Ad-CREB-RNAi-EGFP 1μl。单纯模型组:建立OIR模型后,不给予任何处理。空白载体组:建立OIR模型,在12日龄时双眼玻璃体腔注射浓度为1.0×109 PFU/ml的Ad-EGFP 1μ1。取基因治疗组病毒注射后3日的小鼠和正常对照组小鼠,行视网膜冰冻切片观察病毒转染情况。取各组中17日龄小鼠眼球制作视网膜铺片,行全视网膜血管荧光染色,观察视网膜血管的变化;取各组中17日龄小鼠眼球行石蜡包埋后制作视网膜H&E染色病理切片,并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目。取各组17日龄小鼠视网膜,蛋白质免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测各组小鼠视网膜钙结合蛋白CREB的蛋白表达量和mRNA表达量。结果:小鼠玻璃体腔注射重组腺病毒Ad-CREB-RNAi-EGFP3天后,通过荧光显微镜观察到神经节细胞层(GCL)、内丛状层(IPL)、内核层(INL)、外丛状层(OPL)病毒绿色强荧光,ONL可见少量弱荧光。全视网膜铺片免疫荧光染色结果显示基因治疗组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均显著小于单纯模型组和空白载体组(P<0.05)。视网膜新生血管内皮细胞核计数结果显示基因治疗组视网膜新生血管内皮细胞核数目较单纯模型组和空白载体组显著减少(P<0.05)。Western blot和Real-Time PCR结果显示基因治疗组CREB蛋白表达量和mRNA表达量显著小于单纯模型组和空白载体组(P<0.05)。结论:Ad-CREB-RNA可有效、快速的转染小鼠视网膜,并成功静默CREB基因的表达。CREB基因静默后可显著抑制视网膜新生血管的生成,并有效减少视网膜无灌注区面积,加快无灌注区血管的再血管化。第四部分环磷酸腺苷效应元件结合蛋白基因静默对氧诱导小鼠视网膜新生血管抑制作用机制的研究目的:利用分子生物学实验方法来对静默CREB基因后所产生的抑制新生血管现象的机制进行探讨。方法:将104只7日龄C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、基因治疗组、单纯模型组、空白载体组。正常对照组小鼠:与哺乳母鼠一起在常氧环境下饲养。基因治疗组:建立OIR模型,在12日龄时双眼玻璃体腔注射浓度为1.0×109 PFU/ml的Ad-CREB-RNAi-EGFP 1μl。单纯模型组:建立OIR模型后,不给予任何处理。空白载体组:建立OIR模型,在12日龄时双眼玻璃体腔注射浓度为1.0×109 PFU/ml 的 Ad-EGFP 1μl。Real-Time PCR检测各组 VEGF、HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3、的mRNA表达量;Western blot法检测各组VEGF、HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3的蛋白表达量。结果:基因治疗组小鼠VEGF、HIF-1α、Bcl-2mRNA相对表达量较单纯模型组和空白载体组均有明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。基因治疗组小鼠Caspase-3 mRNA相对表达量较单纯模型组和空白载体组均有明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。基因治疗组小鼠VEGF、HIF-1α、Bcl-2、相对表达量较单纯模型组和空白载体组均有明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。基因治疗组小鼠Caspase-3相对表达量较单纯模型组和空白载体组均有明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CREB基因静默是通过减少对VEGF/HIF-1α通路的刺激上调作用,从而减少了 VEGF的表达,同时减少了其下游因子Bcl-2的表达,降低Bcl-2的促新生血管作用从而减少了新生血管的生成。