论文部分内容阅读
中国对虾(Fenneropenaeus chinensis),隶属节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),游泳亚目(Natantia),对虾科(Penaeidae),明对虾属(Fenneropenaeus),属广温、广盐性、一年生暖水性大型洄游虾类,具有适应能力强、生长速度快、耐低温、营养丰富、长距离洄游等特性,是我国重要的海水养殖品种。中国对虾养殖范围较广,主要分布在我国长江以北的黄渤海沿海地区。由于沿海地区的土壤特性,中国对虾养殖区海水pH普遍偏高,pH值长期处于8.5~9.5之间,在炎热的夏季,受光合作用的影响,海水pH甚至高于9.5。相对于凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus),中国对虾对于pH的耐受性较差,较高的pH对于中国对虾的生长和繁育极为不利,这也成为制约中国对虾大量养殖的重要因素。V-ATPase是一种重要的pH胁迫响应酶,在动植物抗逆抗胁迫过程中发挥了重要作用,但其在中国对虾中尚未有相关报道。本研究以中国对虾为实验对象,对V-ATPase在高pH下的基因应答和功能进行了初步探究,旨在了解V-ATPase在中国对虾抗高pH胁迫中的调节机制,为中国对虾的环境适应性调控机制提供重要数据支持,同时为中国对虾抗逆新品种的培育提供理论参考。研究内容包括以下三个部分:1.中国对虾V-ATPase c、c″和e亚基基因的克隆及序列分析利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆获得中国对虾V-ATPase c、c″和e亚基基因cDNA序列全长,并对序列进行分析。结果表明,中国对虾V-ATPase c亚基cDNA全长为2128bp,开放阅读框长度为483bp,5’端非编码区和3’端非编码区分别包含105bp和1540bp,将该基因命名为FcVHA-c,推测该基因编码160个氨基酸,预测蛋白分子量为16kDa,理论等电点7.82,为疏水性多次跨膜蛋白,包括4个跨膜结构域:TM1~TM4,其中TM4包含一个谷氨酸残基位点。同源性和进化树分析结果显示,FcVHA-c基因编码的蛋白与凡纳滨对虾同源性最高,为99%,并且首先聚为一支,与端足虫(Hyalella azteca)亲缘关系较近。中国对虾V-ATPase c″亚基基因全长为1649bp,开放阅读框长度为633bp,5’端非编码区和3’端非编码区分别包含101bp和915bp,将该基因命名为FcVHA-c″。推测该基因编码210个氨基酸,预测蛋白分子量为21kDa,理论等电点5.09,为疏水性多次跨膜蛋白,包括5个跨膜结构域:TM0~TM4,TM4包含一个谷氨酸残基位点。同源性和进化树分析结果显示,FcVHA-c″基因编码的蛋白与凡纳滨对虾同源性最高,为98.57%,并且首先聚为一支。中国对虾V-ATPase e亚基基因全长为546bp,开放阅读框长度为246bp,5’端非编码区和3’端非编码区分别包含32bp和268bp,将该基因命名为FcVHA-e。该基因编码81个氨基酸,预测蛋白分子量为8.8kDa,理论等电点8.63,为疏水性跨膜蛋白,跨膜1次。同源性和进化树分析结果显示,FcVHA-e编码的蛋白质与柑桔木虱(Diaphorina citri)同源性最高,为67%,与凡纳滨对虾亲缘关系最近。2.中国对虾V-ATPase c、c″和e亚基基因的组织表达分析及其在高pH胁迫下的表达分析采用荧光定量PCR检测V-ATPase c、c″和e亚基基因在中国对虾各组织中的表达,以及在高pH胁迫下各基因在鳃中的表达变化规律。结果表明,FcVHA-c基因在各个组织中均有表达,在鳃中表达量最高,是心脏的14.557倍,其次在眼柄、血淋巴细胞、肠中表达量较高,在心脏中表达量最低。FcVHA-c″基因在中国对虾各组织中均有表达,其中在鳃中表达量最高,是心脏的51.328倍,其次在血淋巴细胞、眼柄和触角腺中表达量较高,在心脏中表达量最低。FcVHA-e基因在各个组织中均有表达,其中在鳃中表达量显著高于其他组织(P<0.05),是眼球的93.972倍,其次在眼柄,肝胰腺和肠中表达量较高,在眼球中表达量最低。上述结果表明,V-ATPase主要在鳃中表达。pH 8.8胁迫下,FcVHA-c、FcVHA-c″和FcVHA-e基因在鳃中的表达随胁迫时间呈现先上升后下降的趋势,分别于胁迫后的12h、12h和24h达到最高值,为对照组的1.206倍、1.574倍和1.790倍。pH 9.2胁迫下,FcVHA-c和FcVHA-e基因的表达呈现先上升后下降的趋势,分别于胁迫后的1h和24h达到最高值,为对照组的1.577倍和3.173倍;FcVHA-c″基因的表达则呈现先上升后下降再上升的趋势,分别于胁迫后1h和48h达到峰值,为对照组的2.834倍和2.384倍。根据上述结果表明,FcVHA-c、FcVHA-c″和FcVHA-e基因在应对高pH胁迫的过程中起到重要的调控作用,不同亚基对高pH胁迫的响应程度和时间不同。3.高pH胁迫下中国对虾V-ATPase的功能研究首先利用siRNA干扰技术分析了中国对虾V-ATPase的功能。分别干扰中国对虾FcVHA-c基因和FcVHA-c″基因,高pH胁迫48h,FcVHA-c干扰组死亡率大于FcVHA-c″干扰组大于对照组,表明V-ATPase c,c″亚基在高pH胁迫中具有调节酸碱平衡的作用。高pH胁迫下,检测CAc、NHE3、AE、NBC和NKCC基因在干扰V-ATPase c亚基后的表达情况,结果显示AE,NBC和NKCC基因均在干扰胁迫后的24h显著上调表达(P<0.05),表明c亚基的表达缺失诱导AE,NBC和NKCC做出积极响应,推测在高pH胁迫环境中,AE、NBC、NKCC与V-ATPase具有协同调节作用。抑制V-ATPase酶活,高pH胁迫48h,抑制组死亡率显著高于对照组,表明V-ATPase参与调节高pH胁迫下中国对虾的酸碱平衡。