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1 胸膜肺炎放线杆菌三种PCR检测方法的评估 血清学诊断方法是常用的App检测手段,但该法应用受到许多方面的限制。近15年来,App PCR检测方法已有许多报道,本实验通过特异性实验、敏感性实验、样品的直接检测等方面,对从已报道的PCR方法中筛选出的3种即apx-PCR、omlA-PCR、cpx-PCP进行了比较,并确定cpx-PCR作为较适合本实验室的最佳检测方法。 2 胸膜肺炎放线杆菌PCR快速分型系统的建立及初步临床应用 根据外膜蛋白基因中间部分的差异,毒素基因和荚膜基因的型特异性,建立3个多重PCR的分型体系,可将Appl~12型分成11个模式,除9型和11型外完全区分。此分型体系用于临床分离株JS3,ZJ5和JS7的分型,得出的结果和血清学分型一致。对人工发病猪扁桃体和肺脏各12份,鼻拭子8份,-20℃保存一年的人工发病猪扁桃体和肺脏各3份分型结果与已知血清型一致。从20份临床可疑病料中检测出2份阳性,均为7型。从健康猪扁桃体250份中检测出3份阳性,一份为4型,一份为12型,一份为3型。 3 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ和Ⅲ基因的串连表达及序列分析 参照GenBank中的App血清8型和10型菌株序列分别设计了一对特异性引物,用PcR方法扩增毒素Ⅰ(ApxⅠ)基因5’端部分基因,得到1047bp的片段,毒素Ⅲ(ApxⅢ基因3’端部分基因,得到868bp的片段,然后重叠延伸剪切术(SOE)将两段PCR产物连接,将连接产物(apxⅠ-apxⅢ)克隆到pMD18-T载体中,经测序比较,与GenBank中公布的序列核苷酸同源性分别达99.3%(毒素Ⅰ)和98.5%(毒素Ⅲ),从T-载体中切下目的片段后,定向克隆到pET32a(+)中,转化BL21(DE3),经诱导后,进行SDS-PAGE实验,目的基因获得表达,免疫转印鉴定呈阳性。apxⅠ-apxⅢ串联基因片段体外成功表达。