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野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的头状花序,本文以产于安徽的药用植物野菊花为研究对象,对其醇提物和不同溶剂萃取物进行抗急性肝损伤测试,从中发现其中保肝活性较强的药效部位;对活性部位进行分离得到8个单体成分,并鉴定各单体成分结构;将得到的单体进行肝星状细胞异常增殖抑制活性筛选;在此基础上,对不同萃取部分的化学成分进行HPLC分析,从而探索野菊花保肝活性的物质基础。本论文分为四部分,具体研究内容如下:1、野菊花提取物抗急性肝损伤活性测试将野菊花用80%乙醇回流提取3次,每次2h,得到野菊花醇提物。将此提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到各萃取物(石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层)。采用ConA尾静脉注射诱导小鼠免疫性肝损伤模型的方法,对野菊花醇提物、乙酸乙酯层、正丁醇层抗急性肝损伤效果进行评价,结果显示以上部分均具有保肝活性,其中乙酸乙酯层比正丁醇层具有更好的保肝活性。2、野菊花活性部位化学成分的分离与鉴定应用大孔树脂、正相硅胶、反相硅胶、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶及制备型高效液相色谱等分离手段对野菊花有效部位进行分离,得到8个黄酮类化合物,通过HPLC、LC-MS、NMR分析后,鉴定出化合物分别为6-甲氧基-5,7,4′-三羟基黄酮(高车前素,Ⅰ)、5,6,7,4′-四羟基黄酮(野黄芩素,Ⅱ)、3,6,8-三甲氧基-5,7,3′,4′-四羟基黄酮,Ⅲ、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-α-L-鼠李糖苷(异野漆树苷,Ⅳ)、5,7,4’-三羟基-3,6,3’-三甲氧基黄酮(棕鳞矢车菊黄酮素,Ⅴ)、刺槐素-7-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-α-L-鼠李糖苷(蒙花苷,Ⅵ)、5,7-二羟基-4’-甲氧基黄酮(刺槐素,Ⅶ)、3,5,7,3’,4’-五羟基黄酮(槲皮素,Ⅷ)。其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ均为首次从野菊花中分离得到。3、野菊花保肝活性部位分离的单体成分抑制肝星状细胞增殖能力测试采用MTT法对分离得到的野菊花单体成分对TGF-β1刺激的肝星状细胞(HSC-T6)进行保肝活性筛选。评价不同单体抑制HSC增殖的能力。结果显示受试的10个化合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ,含前期自野菊花中分离的3个咖啡酰奎宁酸)对HSC的增值均表现出一定的抑制活性。其中以化合物Ⅷ和3个咖啡酰奎宁酸(本课题组前期分离得到)活性最为突出,IC50值<100μM。此外化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ对HSC-T6的增殖也显示出较好的抑制活性,IC50值在150~300μM。蒙花苷(化合物Ⅵ)抑制增殖的能力最差,IC50值超过600μM。4、野菊花保肝活性成分的初步分析对野菊花样品进行初步的HPLC分析,通过比对分离得到的8个单体在野菊花样品中的保留时间(RT)确定单体在样品中的存在,运用峰面积归一法计算分离得到的8个单体的含量。结果表明分离得到的8个化合物在野菊花提取物及不同萃取部分中的含量分布存在明显的差异。在被测的8个化合物中,以蒙花苷(Ⅵ)、槲皮素(Ⅷ)等常见化合物的含量较高,化合物Ⅴ的含量最低。对HSC抑制活性较好的化合物Ⅳ和Ⅷ在正丁醇部分中含量较高。结合本课题组前期含量测定实验结果说明在不同萃取部分中活性较好的3个咖啡酰奎宁酸中3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸含量差异明显,以在乙酸乙酯萃取部分中含量最高,这与肝损伤实验结果相一致,说明这2个有机酸类物质可能是造成野菊花不同萃取部位保肝活性差异的主要药效成分之一。