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保幼激素（juvenile hormone,JH）是节肢动物中一种重要的内分泌激素,在许多昆虫和甲壳动物的生长变态发育调控中具有十分重要的作用。甲基法尼酯（methyl farnesoate,MF）是JHIII的前体物质,并且昆虫的JH和甲壳中的MF在生理功能以及结构上都具相似性,被认为是甲壳动物中的保幼激素。JH在昆虫变态发育过程中主要通过拮抗蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）从而“维持现状”,其拮抗机理伴随着近年来JH受体Met（methoprene-tolerance,Met）的剖析也渐渐清晰;并且Kr-h1（kruppel homolog 1,Kr-h1）作为JH信号通路的关键基因,已在多个昆虫物种中被鉴定出是由Met诱导激活的JH初级响应基因。然而目前关于Met基因是否能够作为甲壳动物MF的受体尚存在较大疑点,需要进一步验证。拟穴青蟹（Scylla paramamosain）主要分布在我国东南沿海地区,是一种重要的经济养殖蟹类,其营养价值高,市场接受范围较广。本研究以拟穴青蟹为研究对象,从分子生物学水平对其生长发育过程中具有关键作用的保幼激素信号通路进行了初步研究,主要研究结果如下:1.通过MF、JH III、Methoprene及Lovastatin等外源激素的处理观察青蟹幼体活性状态的变化,以及对其蜕皮或变态的影响,进而分析其JH以及JH类似物在拟穴青蟹幼体发育过程中的调控作用。结果显示,一定浓度的MF、JH III和Methoprene能延长变态周期,甚至导致幼体死亡率的增加;同时MF的缺失导致幼体蜕皮率增加,死亡率升高。本实验初步验证了JH及其类似物可能会影响拟穴青蟹幼体的正常生长发育和变态,证明了MF在拟穴青蟹幼体发育中可能具有的重要作用。本实验为后续研究的开展奠定了一定的数据基础。2.实验利用RACE克隆了拟穴青蟹Met基因的全序,定名为Sp-Met。从青蟹肝胰腺组织克隆获得的Met序列全长与卵巢中的略有差别,两条序列的一致度为99.55%,仅有五个氨基酸的差别。卵巢中Sp-Met的cDNA序列全长为3668 bp,开放阅读框为3351 bp,可编码氨基酸1116个;预测分子量为12.43 KD,pI为6.25。肝胰腺中的Met全长为3683 bp,开放阅读框有3366 bp,可编码氨基酸1121个,有同样的205 bp的5′UTR和112 bp的3′UTR,等电点相同。Sp-Met的氨基酸序列包含三个独立的典型结构域,包括一个bHLH和两个PAS,这是bHLH-PAS蛋白家族的标志。成体蟹中Sp-Met基因在所检测的组织中均有表达,其中在性腺中的表达量较高,远高于其他组织;其次血淋巴、肝胰腺和胃。因此,推测出甲壳类动物中Sp-Met基因在卵巢和肝胰腺组织的高表达可能与MF信号转导有关;不同卵巢发育时期结果分析表明Sp-Met基因在卵黄发生中可能具有重要的作用。体外处理MF结果表明高浓度MF能够明显上调Met的表达,说明Sp-Met对MF具有响应性,提出了Met作为MF受体的可能,这些发现也进一步描述了甲壳动物中MF信号转导的特征。该研究对青蟹MF信号通路研究提供依据,具有一定的推动作用。3.实验首次克隆获得了青蟹Kr-h1基因的全长,命名为Sp-Kr-h1。Sp-Kr-h1的cDNA序列全长为3135 bp,ORF为1812 bp,可编码603个氨基酸。此外,有1045 bp的5′UTR和278 bp的3′UTR,其中3′UTR区域含有典型的加尾信号AATAAA和poly A尾。SMART预测出Sp-Kr-h1有7个C2H2锌指结构域和一个螺旋卷曲域。与水蚤中的7个锌指结构域一致,与昆虫相比却丢失了一个锌指结构域。多序列比对也表明Kr-h1在不同物种间具有保守性。此外系统发育树分析表明,Kr-h1在进化上与传统分类学一致。不同时期幼体表达特异性分析表明,Kr-h1在Z5时期最低,与Met表达量相似;并且不同浓度的MF以及保幼激素类似物均能明显上调Kr-h1的表达。这些结果初步表明了MF与Kr-h1的相关性,推测Kr-h1可能作为MF信号通路下游的关键基因。该研究为青蟹MF信号通路的阐明提供理论基础,有助于下一步研究的开展。综上所述,本研究对拟穴青蟹保幼激素MF信号通路的关键基因Met、Kr-h1进行首次克隆并对其进行初步基本生物信息学分析,高浓度的MF诱导Sp-Met基因的表达,证明了Sp-Met对MF具有响应性;尽管其中两个变异位点可能造成了Met结合JH和MF能力的不同,但推测认为Met最可能作为MF的受体;此外虽然Kr-h1在低等甲壳动物中发生了功能变化,但推测高等甲壳动物中的Kr-h1仍延续了在昆虫中的保守性,认为Kr-h1为MF信号通路的关键下游基因是通过MF结合Met进而诱导其表达。本研究对MF→Met→Kr-h1的保守性及作用进行了初步分析,同时构建了UAS-Met和UAS-Kr-h1载体为后续实验做准备;本研究进一步描述了甲壳动物中MF信号转导的特征,推动了MF信号通路的研究,并且对保幼激素类似物的应用前景提供了科学指导。