自噬(autophagy)是一种在真核细胞内普遍存在自我分解代谢机制。在特定的生理条件下,细胞能够通过形成具有双层膜结构的自噬小体对自身的蛋白多聚体、细胞器以及细胞骨架等组分进行包裹并运送到溶酶体进行降解,从而实现对细胞代谢、功能和结构的动态调节。在哺乳动物细胞中,自噬的诱导与细胞死亡、增殖、迁移、分化以及激素分泌等一系列细胞生理活动密切相关。目前的研究已经表明自噬是支持细胞功能正常运行的重要机制,自噬调节的异常与哺乳动物多种疾病的发生息息相关。哺乳动物细胞内自噬的诱导和功能受到多种上游蛋白的调节。在生殖系统中,细胞的自噬水平还受到各种促性腺激素的调节作用。本课题的研究旨在揭示自噬在哺乳动物卵泡发育、黄体形成、功能发挥以及退化过程中的调节作用。此外,我们也致力于探索自噬在卵巢病理条件下对卵泡发育的调控作用及其分子机制。本文的主要研究结果如下所述:1、首先,通过PMSG诱导卵巢卵泡发育模型阐明缺氧诱导因子-1a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)介导的自噬在卵泡发育过程中的作用及其调控机制。本实验通过对卵巢内HIF-1a以及自噬标志蛋白LC3的检测发现HIF-1a和LC3在卵泡发育过程中均显著升高,进一步分析发现HIF-1a下游蛋白BNIP3的表达与HIF-1a的表达一致,也显著增加。抑制HIF-1a后,卵巢细胞内BNIP3的表达与自噬水平均下降。与正常对照组相比,抑制HIF-1a并不会对卵巢内SOD水平造成明显变化但会导致卵巢中ROS水平的上升。蛋白印迹结果发现抑制HIF-1a后,卵巢细胞的凋亡水平显著增加。这些结果表明,HIF-1a/BNIP3信号通路介导的自噬在卵泡发育过程中通过清除卵巢ROS促进颗粒细胞在缺氧条件下的存活,从而维持卵泡发育正常。2、其次,通过妊娠黄体发育模型阐明了自噬在黄体发育过程中的表达及其调控作用。本实验通过建立黄体发育模型对黄体细胞中的自噬相关蛋白的表达以及自噬水平的变化进行了检测。实验结果表明,LC3主要在黄体细胞中表达,且在后期黄体中LC3的表达水平显著增加。同时,后期黄体中黄体细胞的凋亡水平与自噬体聚集程度均明显增加,而黄体细胞内溶酶体功能蛋白LAMP-2的表达水平却明显降低,使溶酶体的降解能力显著减弱。这些结果表明,在后期妊娠黄体中LAMP-2表水平的降低造成了溶酶体降解能力的下降,促进了黄体细胞中自噬体的聚集从而导致了黄体细胞凋亡水平的显著上升。3、再次,通过体外细胞培养和体内动物实验进一步分析了 HIF-1a介导的自噬在卵巢颗粒细胞分化及黄体早期形成中的作用及其调控机制。本实验通过体内和体外实验发现HIF-1a表达水平的增加对促进颗粒细胞分化标志蛋白StAR表达起到重要作用,抑制HIF-1a会降低StAR的表达。进一步研究发现在颗粒细胞的分化过程中自噬水平也明显提高,抑制自噬同样能够降低StAR的表达。通过siRNA沉默BNIP3的表达能抑制HIF-1a诱导的颗粒细胞分化及自噬水平。通过HIF-1a特异性抑制剂棘霉素(echinomycin,Ech)抑制HIF-1a能够促进黄体细胞内线粒体细胞色素C的释放以及caspase-3的激活。这些结果表明HIF-1a/BNIP3信号通路介导的自噬参与了卵巢颗粒细胞的分化及黄体早期的发育过程。4、接着,通过体外细胞培养和体内动物实验进一步分析了自噬在妊娠黄体功能维持中的作用及其调控机制。考虑到孕酮生成是黄体功能的主要功能之一,本实验通过采集妊娠黄体中晚期样品并通过免疫组化、蛋白印迹等分子生物学检测技术对黄体细胞自噬水平与孕酮生成情况进行检测,从而阐明自噬对妊娠黄体孕酮生成的调节作用及其机制。结果发现,自噬具有促进黄体细胞中脂滴储存的作用,抑制自噬会降低黄体细胞内的脂滴数量并导致血清孕酮水平的下降。抑制Akt/mTOR信号通路则促进黄体细胞的自噬水平。体外细胞培养实验进一步发现抑制mTOR活性将促进自噬水平及孕酮生成能力的增加,而抑制自噬则降低黄体细胞的孕酮生成能力。这些结果表明自噬在妊娠过程中通过调节黄体细胞中脂滴储存对黄体功能的维持与孕酮的生成具有重要的调节作用。5、然后,通过假孕黄体发育模型利用自噬诱导细胞凋亡的机制对黄体功能性退化与结构性退化过程进行了研究。本实验首先构建了假孕黄体发育模型,然后检测黄体细胞中自噬水平的变化与细胞凋亡的情况,从而阐明HIF-1a介导的自噬在卵巢黄体退化过程中的作用及其调控机制。结果表明,在黄体结构性退化过程中HIF-1a及其下游自噬调节蛋白BNIP3和NIX的表达水平显著增加。在晚期黄体中,自噬的起始是通过非Bec1in1途径进行的,同时还存在自噬体聚集的现象。另外,在晚期黄体中,黄体细胞的凋亡水平也显著增加。利用棘霉素(Ech)特异性抑制HIF-1a活性可显著改善黄体细胞凋亡导致的黄体结构萎缩,这与BNIP3和NIX的表达、细胞自噬以及凋亡水平的变化一致。这些结果表明HIF-1a介导的自噬通过调节黄体细胞凋亡,从而参与黄体结构性退化。6、最后,为了阐明HIF-1a介导的自噬在卵巢生理病理条件下的作用和意义,本实验通过碳酸二甲酯(dimethyl carbonate,DMC)诱导了卵巢毒性实验,然后检测了卵巢细胞中的自噬水平及其变化,从而阐明HIF-la介导的自噬在卵巢毒性中的作用及其调控机制。结果发现,在中剂量(0.6g/kg BW)和高剂量(6g/kg BW)中,卵巢卵泡结构被明显破坏且颗粒细胞凋亡水平显著增加,而在低剂量组(0.06g/kg BW)中,卵巢卵泡结构基本正常,除Bcl-2的表达水平上调外,促凋亡蛋白的表达水平没有明显变化。随后,通过对HIF-1a信号通路及自噬相关蛋白的检测发现低剂量DMC处理可激活颗粒细胞内HIF-1a/BNIP3通路并诱导颗粒细胞的自噬水平上升,而中/高剂量DMC处理则抑制了 HIF-1a/BNIP3通路并促进了颗粒细胞中自噬体的聚集,从而诱导卵巢颗粒细胞的凋亡与卵泡的闭锁。这些结果表明HIF-1a介导的自噬在低剂量DMC诱导的卵巢毒性中具有保护作用,而在高剂量DMC诱导的卵巢毒性中具有诱导细胞凋亡的作用,表明了自噬在不同生理条件下具有不同作用这一双重机制。本课题首先证实了 HIF-1a介导的自噬对卵巢卵泡颗粒细胞的保护作用;其次发现了 HIF-1a介导的自噬参与了卵巢颗粒细胞分化与妊娠黄体的早期发育;然后揭示了自噬在妊娠黄体发育过程中的变化规律以及其通过调节脂滴储存对孕酮生成的调节作用;接着发现了 HIF-1a介导的自噬在假孕黄体结构性退化过程中对黄体细胞凋亡的促进作用。最后,通过DMC诱导的卵巢毒性阐明了 HIF-1a介导的自噬在卵巢病理条件下的作用及其调控机制。这些研究结果为进一步了解哺乳动物卵巢的卵泡发育、黄体形成、黄体功能调节以及黄体退化过程提供了重要实验数据与理论基础,为临床上调控黄体功能提供了新的研究方向与理论依据。