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研究背景：原发性肝细胞肝癌(hepatocellular cell carcinoma, HCC,简称“肝癌”)是最常见的原发于肝脏的恶性肿瘤,在世界范围内,其发病率占恶性肿瘤的第5位,死亡率居第3位。早期肝癌治疗的主要手段是手术切除、肝移植和局部消融治疗,可使患者获得超过50%的5年生存率,但仅不足30%的患者有机会接受根治性治疗,大多数患者发现时已是晚期、或在根治术后复发、转移,需要接受肝动脉栓塞化疗(TACE)、索拉非尼或全身化疗等姑息治疗方法。但无论是接受局部的肝动脉栓塞化疗还是系统性的化疗,多数患者仍将面临因肝癌进展、转移或继发耐药而导致的治疗失败。肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSCs)是近年来肿瘤学研究的一个热点。目前认为,CSCs是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞特性的细胞群体,它们具有自我更新能力,形成不同分化程度的肿瘤细胞。由于对常规化疗药物和现有的靶向治疗耐药,造成肿瘤增殖、转移和耐药。虽然对CSCs重要性的认识不断加深,但是对于其细胞起源仍存在争议,究竟是源于正常干细胞发生的恶性转化还是已分化的肿瘤细胞获得的自我更新能力目前还不清楚。有研究显示,化疗药物治疗后可导致未能清除的残留肝癌细胞生物学特性恶化,发生上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)和“干性”(stemness)增强。ID1作为一个癌基因,在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。ID1高表达可使肿瘤细胞获得类似于干细胞的特性,促进肿瘤的转移和耐药。本课题组的前期研究中,运用全基因组芯片筛选并验证奥沙利铂治疗组和对照组肝癌皮下瘤差异基因,发现奥沙利铂治疗组裸鼠肝癌皮下瘤组织ID1表达明显上调,提示ID1在奥沙利铂治疗后干性转化中起着重要的作用。基于此研究结果,本课题的目的在于通过研究ID1在化疗诱导肝癌细胞发生“干性”改变中的作用,了解IDl调控干性改变的可能分子机制,为干预肝癌耐药、探索针对肝癌干细胞的靶向治疗打下理论基础。方法首先建立奥沙利铂耐药的肝癌细胞株。选用高转移潜能的人肝癌细胞株MHCC-97H,以梯度浓度2、5、25μmol/L奥沙利铂序贯培养,使细胞逐步耐受奥沙利铂并稳定生长,最终获取细胞株并命名为MHCC97H-OXA。CCK8方法检测其对奥沙利铂的敏感性,通过检测CSC相关分子标志以及转移、“干性”功能验证肝癌耐药细胞株的“干性”特征。进一步构建干扰(ID1-KD)和过表达ID1 (ID1-OE)的不MHCC-97H细胞稳定株,确定ID1调控肝癌细胞“干性”的机制。最后用免疫组织化学染色方法对152例手术切除的原发性肝癌患者的组织芯片进行分析,Kaplan-Meier方法计算总生存期和无复发生存期,Log-rank方法比较高表达组和低表达组两组间的差异。结果1.运用CCK8方法检测肝癌细胞株MHCC-97H和其相应的耐药细胞株MHCC97H-OXA对奥沙利铂的药物半数抑制浓度(IC50),验证了耐药株的耐药性(P<0.0001)；但其增殖速度明显低于野生型株(P<0.0001)。WB比较MHCC-97H和MHCC97H-OXA细胞中Aurora-A和IDl的表达,发现MHCC97H-OXA中Aurora-A和ID1表达均较野生株升高。通过划痕实验分析耐药细胞株的迁移能力,结果发现MHCC97H-OXA细胞株的迁移明显增强(P<0.0001)。进而通过Transwell实验分析耐药细胞株的侵袭能力,发现MHCC97H-OXA细胞株的侵袭能力显著增强(P<0.0001)。为进一步分析奥沙利铂耐药株的成瘤能力,我们做了平板克隆形成实验,发现尽管耐药株的增殖变慢,但是其克隆形成能力明显增强(P=0.0002)。2.通过病毒介导的基因转染构建ID1干扰或过表达的MHCC-97H细胞株,分别命名为ID1-KD和ID1-OE,观察敲低或过表达ID1对肝癌细胞干性的影响。与对照组相比,ID1敲低后细胞的迁移能力显著下降(P=0.002)；侵袭能力下降(P=0.01)；克隆形成能力也显著下降(P<0.0001),对奥沙利铂的敏感性显著增强(P<0.0001)。反之,与对照组相比,ID1过表达的MHCC-97H细胞株(ID1-OE)中,克隆形成能力显著增强(P=0.0003),对奥沙利铂的敏感性显著下降(P<0.0001)；ID1敲出后,伴有Aurora-A激酶表达下降,而ID1过表达后,Aurora-A激酶的表达同时上调。3. Aurora-A抑制剂VX-689可遏制ID1诱导的克隆形成能力(P<0.0001),显著增加其对奥沙利铂的敏感性(P<0.0001)。而且VX-689 500nM作用于MHCC97H-OXA细胞后,可降低Aurora-A激酶活性,表现为p-Aurora A (Thr288)的表达下调,同时耐药细胞的迁移能力(P<0.0001)、侵袭能力(P<0.0001)、克隆形成能力均明显受抑(P<0.0001),VX-689也逆转了MHCC97H-OXA细胞的耐药性(P<0.0001)。4.对152例HCC患者的组织进行免疫组化分析,中位随访时间为51.17±21.46个月。Aurora-A高表达患者58例,低表达94例。低表达组的中位0S尚未达到,高表达组的中位0S为30个月,P<0.001；低表达组的中位RFS尚未达到,而高表达组的中位RFS为15个月,两组间比较P值<0.001。ID1高表达组患者68例,低表达患者84例,低表达组的中位OS尚未达到,高表达组的中位OS为35个月,P<0.001；ID1低表达组的中位RFS也未达到,而高表达组的中位RFS为23个月,P=0.0013。用Pearson Correlation分析显示,Aurora-A与ID 1两者相关系数=0.285,P<0.001。多因素分析显示,Aurora-A和ID1分别是与肝癌患者OS相关的独立预后因素,Aurora-A也是与RFS有关的独立预后因素。Aurora-A和ID1同时高表达组的患者预后最差,中位OS和RFS较仅Aurora-A或ID1为高表达或同时为低表达/阴性组的中位OS和RFS均明显缩短,P<0.001。结论：1.体外细胞水平研究显示,耐药的MHCC97H-OXA细胞株Aurora-A表达升高并伴有干性相关因子和功能的增强。2.分化抑制因子ID1是调控肝癌细胞发生干性表型转化的关键因子,干扰ID1表达可以抑制其干性和耐药。3.ID1可通过Aurora-A的介导促进HCC细胞发生干性转化。抑制Aurora-A活性可以逆转ID1诱导的干性及耐药。4. Aurora-A及ID1是与肝癌患者0S有关的独立预后因素,Aurora-A也是与RFS有关的独立预后因素,两者表达密切相关。Aurora-A和ID1同时过表达的患者无复发生存期和总生存期最短,预后最差,从临床上验证了Aurora-A和ID1间的互相促进关系,两者同时过表达的患者更容易复发和进展。应用价值：1.明确了化疗后肝癌细胞的耐药性与残余肿瘤细胞的”干性”增强有关,有助于开发靶向作用于肿瘤干细胞的药物以克服传统化疗无法根除肿瘤细胞的不足,降低HCC的转移和复发。2.ID1是调控肿瘤细胞发生“干性”转化的关键因子,阻断ID1有助于逆转HCC的“干性”。ID1是值得进一步探索治疗靶点。3. Aurora-A可介导ID1调控HCC的“干性”转化,抑制Aurora-A激酶可干扰ID11诱导的“干性”改变和耐药；而阻断Aurora-A激酶活性可以克服化疗后诱导的“干性”。本实验为Aurora-A抑制剂用于HCC的临床试验提供了理论基础。4. Aurora-A和IDI是预测HCC患者手术后死亡和复发风险的重要预后因素,有助于我们更新HCC的预后预测模型,指导临床对高危患者选择更积极的治疗和更合理的随访创新点1.首次证实了Aurora-A是介导ID1诱导肝癌细胞发生“干性”转化的中间调控分子之一。2.首次证实了HCC组织中ID1与Aurora-A的表达密切相关,Aurora-A、ID1是与HCC患者0S相关的独立预后因素。