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研究背景和目的：
端粒酶是由催化蛋白亚基和RNA亚基组成的逆转录酶，它能够以其自身的RNA作为模板，补充端粒末端在DNA复制过程中丢失的序列。在正常体细胞中端粒随着细胞的分裂而不断缩短其长度直至一临界值可致该细胞衰老甚至死亡。相反，在85%以上的肿瘤细胞中端粒酶都有表达，其对于肿瘤细胞的增殖有着重要的作用。因此，以端粒酶为靶点筛选端粒酶特异抑制剂是近年来寻找新抗肿瘤药物的热点。目前，还没有端粒酶抑制剂特异的筛选模型。本课题组设计了端粒酶主要成分即端粒酶逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）和起模板作用的端粒酶RNA（humantelomeraseRNA，hTR）相互作用的酵母三杂交模型。
酵母的转录因子2个功能部分LexA（DNA结合结构域）和Gal4-AD（转录激活结构域）被人为分开，其中LexA通过MS2衣壳蛋白与hTR连接（诱饵，bait），Gal4-AD与hTERT连接（猎物，prey）。由于hTR与hTERT可特异性结合，使酵母的转录因子的2个功能部分相互靠拢而启动报告基因的表达。但当hTR与hTERT之间存在抑制hTR与hTERT结合的因素时（Inhibitors，Is），报告基因不表达。通过选择性培养酵母，就可以筛选抑制hTR与hTERT特异结合的抑制剂。
由于hTR中若干序列会影响RNA的正常转录故本课题组对其进行基因突变并构建含人端粒酶RNA突变体的酵母三杂交诱饵质粒，而后与含hTERT的猎物质粒共转染入宿主酵母菌，得针对端粒酶主要成分即端粒酶逆转录酶和起模板作用的端粒酶RNA相互作用的基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型。
方法：
1、端粒酶RNA（hTR）基因的定点突变
根据hTR的DNA序列中三处连续四个或四个以上碱基T串联排列部分并结合突变前后杂交RNA分子二级结构的分析进行突变位点的设计，确保可作为转录终止信号的串联碱基T的连续性中断并且保证突变前后的杂交RNA二级结构没有很大的变化，其中的MS2RNA的茎环结构亦仍独立存在，也就是使突变不影响MS2RNA与酵母三杂交系统中杂交蛋白的结构并共同行使激活RNA聚合酶引起报告基因转录的能力。根据以上要求拟定在hTR基因第41、80及102位碱基运用重叠延伸PCR法（overlappingextensionPCR，OE-PCR）进行T→A的点突变。根据hTR的DNA序列及突变位点，按照引物设计原则，采用引物设计软件（PrimerPremier5．0）设计引物。重叠延伸PCR单个位点定点诱变需要三个PCR反应来完成，本研究中需突变三个位点，故进行三次循环，得突变产物hTRm。产物进行TA克隆连接转化，菌落PCR筛选阳性克隆，小量抽提质粒PMD18T-hTRm，送重组质粒测序验证突变是否成功。
2、基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的构建
（1）酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2表型及自激活性的检测
将酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2（已经引入了pHyblex/ZeoMS2质粒的酵母菌株L40ura3）分别涂布于营养缺陷培养基YC-U，YC-W，YC-H，YC-UWH上并观察其生长情况来验证该酵母表型，并检测其β-半乳糖苷酶活性即自激活性。
（2）人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建
将PMD18T-hTRm和PRH3'质粒进行AvrⅡ、AatⅡ双酶切后重组诱饵质粒PRH3'-hTRm，对重组质粒进行PCR及酶切鉴定，鉴定为成功构建后，将该重组诱饵质粒电转染入酵母菌L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2感受态细胞中，而后涂布于营养缺陷培养基YC-U，YC-W，YC-H，YC-UWH上观察其生长情况，并检测其自身毒性。
（3）3-氨基-1，2，4-三氮唑（3-Amino-1，2，4-triazole）即3-AT抗性分析
将质粒PRH3'侗pYESTrp3，阳性对照质粒pRH3'/IRE同pYESTrp3/IRP分别共转染入酵母L40ura3/pHyblex/ZeoMS2中，分别涂布于含不同浓度3-AT的营养缺陷培养基YC-H上，并观察其生长情况从而确定最大限度消除假阳性需加入的3-AT的浓度值。
（4）基于酵母三杂交系统的端粒酶抑制剂筛选模型的初步构建
将猎物质粒pYESTrp3-hTERT（1-608），pYESTrp3-hTERT（17-593），pYESTrp3-hTERT（292-608），pYESTrp3-hTERT（292-952）中的任意一个与诱饵质粒PRH3'-hTRm一一配对，采用电击转染的方法共转入酵母菌株L40ura3/pHyblex/Zeo-MS2中，将共转染后的酵母菌株分别涂布于营养缺陷培养基YC-UZ，YC-WZ，YC-HZ，YC-UWHZ上并观察其生长情况。
（5）β-半乳糖苷酶活性分析
将营养缺陷培养基YC-UWHZ上生长的菌落进行β-半乳糖苷酶活性分析来确定hIR与hTERT片段是否结合，并可以初步筛选阳性克隆。
（6）反复传代排除假阳性克隆
反复传代三次，且每次传代后均进行β-半乳糖苷酶活性检测。
（7）菌落PCR筛选阳性克隆
选择上一步骤中β-半乳糖苷酶活性分析为阳性的菌落进行菌落PCR进一步筛选阳性克隆。100℃水浴10分钟裂解酵母，离心取上清作为模板，进行PCR验证酵母菌中是否成功转入含hTRm的诱饵质粒，在确证含hTRm的诱饵质粒成功转入的基础上，进行二次PCR，验证含hTERT片段的猎物质粒是否成功转入，取两次PCR均为阳性的酵母菌进行保菌备用。
结论：
1、成功构建了hTR突变体的重组质粒PRH3'-hTRm，可作为酵母三杂交系统中的“诱饵”。
2、成功构建了针对端粒酶主要成分即端粒酶逆转录酶和起模板作用的端粒酶RNA相互作用的，基于酵母三杂交系统的端粒酶特异抑制剂高通量筛选模型。