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目的:肝癌已经成为全世界发病率较高的肿瘤之一。其中,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)约占肝癌发病率的80%到90%。近几年有一类非编码的小RNA分子——microRNAs(miRNAs)被人们发现,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。MicroRNA长度在19到25个核苷酸,可与目标mRNA在3’非编码区(untranslated regions,UTR)发生连接,从而引起mRNA的降解或抑制mRNA的翻译。MiRNA参与生命中的一系列的重要进程,包括:细胞增殖、凋亡、分化等。随着研究逐步深入,一些与肝细胞癌潜在相关的信号通路通过多种mRNA调节途径逐渐被人们了解,也进一步揭示了多种miRNA在人类恶性肿瘤存在异常表达,不同的肿瘤miRNA变化的趋势也有差异,表明miRNA可能参与癌基因或抑癌基因而发挥其功能。在目前针对肝细胞癌的组织及细胞的诸多miRNA差异表达研究中,miR-122在70%肝细胞癌中以及全部的肝细胞癌衍生细胞株中表达是下调的。作为肿瘤标志物之一,miR-122参与调节肝癌在肝内的转移,在肝内转移的肝癌中显著下调甚至缺失。PSMD10又称Gankyrin,是一个由226个氨基酸组成的分子量约为25KD的蛋白质。PSMD10在肝癌组织中表达均呈现高水平。PSMD10还是一种抗凋亡的癌蛋白,体内体外实验都证实过表达PSMD10可以提高肿瘤细胞的抗凋亡能力。为了确定miR-122是否通过调节PSMD10的表达,而影响肝癌细胞的凋亡过程,最终影响化疗药物治疗的敏感性。本研究采用蛋白质组学的方法,以miR-122低表达(转染miR-122抑制剂)的Huh7细胞作为模型,旨在寻找到miR-122调节PSMD10的作用环节或排除已知的其他环节,并进一步探索在miR-122调节细胞凋亡及化疗药物敏感性的通路,及PSMD10在其中发挥的作用。方法:1构建miR-122低表达的肝癌细胞模型向Huh7细胞瞬时转染miR-122抑制剂(miR-122 inhibitor)及对照RNA,48h后收集细胞。提取细胞总RNA,经RT-PCR获得cDNA模版,进而采用Real-time PCR方法分别测定mRNA水平,判断miR-122抑制剂干扰效果。2确定miR-122下调对PSMD10产生的影响向Huh7细胞转染miR-122抑制剂(miR-122 inhibitor)及对照RNA,48h后收集细胞制备成蛋白样。采用western blotting检测,观察PSMD10表达的变化。3构建pMIR-3’UTR双荧光素酶报告质粒将人工合成的CDK4 3’UTR片段连接到pGL3-promoter vector质粒基因上,构建成pMIR-3’UTR荧光素酶报告质粒。4确定miR-122的靶基因将pMIR-3’UTR质粒转染至Huh7细胞中,同时转染miR-122抑制剂、miR-122模拟剂和阴性对照RNA。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒和western blot方法检测。5确定miR-122上调PSMD10的环节从mRNA水平,蛋白合成,蛋白酶体三方面开展了实验。mRNA水平的实验:对比瞬时转染miR-122抑制剂与对照RNA的Huh7细胞的miR-122在mRNA水平的表达量。蛋白合成及蛋白降解实验:向Huh7细胞铺于6孔板中,分别转染miR-122抑制剂及对照RNA ,24h后分别添加蛋白合成抑制剂CHX(亚胺环己酮)(0.5μg/ml),和蛋白酶体抑制剂MG-132(5μg/ml),并于转染后48h收集细胞制备成蛋白样,western blot检测PSMD10的表达变化。6确定CDK4在miR-122调节PSMD10表达的作用。向Huh7细胞中转染抑制CDK4的siRNA(siRNA/ CDK4)、miR-122抑制剂及对照RNA 48h后,收集细胞制备成蛋白样,采用western blot方法检测PSMD10的表达量。7观察下调miR-122表达对肝癌细胞凋亡的影响将miR122抑制剂及对照RNA的瞬时转染至Huh7细胞,8h后用PBS清洗细胞并用胰酶消化细胞,转移种植于96孔板中。24h后添加顺铂(cisplatin)刺激,浓度分别为:0,2,8,12.5,20μg/ml,以MEM培养基作为空白对照,顺铂刺激2h后,应用CCK8实验检测,在450nm下检测OD值,以判断活细胞数及凋亡影响。同样的转染及添加化疗药的方法,于添加顺铂后24收细胞制备成蛋白样品,western blot检测8μg/ml的顺铂刺激下C-caspase3的表达量。8探索PSMD10在miR-122调节肝癌细胞凋亡机制中的作用向Huh7分别转染mirR-122抑制剂、对照RNA、干扰PSMD10的siRNA及其对照RNA。24h后,用PBS清洗4组细胞,胰酶消化后铺于96孔板(2块)。于转染后48h加入顺铂刺激,(浓度梯度为0,2,8,12.5,20μg/ml,每个浓度重复6个孔,每孔100μl MEM培养基)。应用CCK8实验检测。结果:1转染miR-122抑制剂的Huh7细胞的miR-122的mRNA水平表达量明显下降(Fig.1A)。2下调miR-122的表达可引起Huh7细胞中PSMD10表达的显著上调(Fig.1B,C)。3双荧光素酶报告基因检测:与对照相比,转染miR-122模拟剂的细胞相对荧光素酶活性明显降低(Fig. 2B),而在转染miR-122抑制剂的细胞中相对荧光素酶活性明显升高(Fig. 2C)。Western blot方法检测CDK4的含量:CDK4的表达量在miR-122抑制剂细胞中升高,miR-122模拟剂细胞中降低(Fig. 2D),与对照组相比,具有显著性差异(p<0.05)(Fig. 2E)。因此可确定CDK4为miR122的靶基因。4添加蛋白合成抑制剂CHX的细胞中,与对照组相比,转染miR-122抑制剂的细胞的PSMD10表达量仍然明显上调;相反的,MG-132阻止了转染miR-122抑制剂的引起的PSMD10的上调(Fig.3)。由此可以确定:miR-122抑制剂上调PSMD10的环节在于减少了蛋白降解。5与转染阴性对照siRNA细胞相比,对于同时转染CDK4 siRNA和miR-122抑制剂的Huh7细胞,其PSMD10表达水平降低。因此,miR-122通过其靶基因CDK4加强PSMD10的表达。6通过CCK8检测,转染miR122抑制剂细胞成活的数量始终高于对照组。在8μg/ml,12.5μg/ml浓度下,miR-122抑制剂可使Huh7产生明显的药物抵抗(Fig. 5A)。Western blot结果:在转染miR-122抑制剂的Huh7细胞中,C-caspase3表达量降低(Fig. 5B),说明凋亡标志物的减少说明:miR-122抑制剂对细胞产生了抗凋亡的作用。7下调PSMD10的表达增加Huh7细胞的凋亡(Fig. 6),此结果验证了PSMD10的抗凋亡作用。进而得到结论:miR-122通过调节PSMD10进而对影响肝癌细胞凋亡。结论:1 miR-122在调节细胞凋亡和肿瘤治疗中发挥重要作用。下调miR-122的表达,可增强细胞的抗凋亡能力,也增加了肝癌对化疗药物的抵抗,降低了对化疗药物的敏感性。这可能为miR-122低表达肝癌的治疗提供新的思路。2癌蛋白PSMD10参与了miR-122调节细胞凋亡的机制,并发挥重要作用。下调表达miR-122可增加PSMD10表达的上调,同时可增加细胞的抗凋亡能力;干扰PSMD10的表达,则miR-122下调引起的肝癌细胞的凋亡明显增多,抗凋亡能力减弱。由此可见PSMD10在miR-122调节细胞凋亡的途径中,发挥着重要作用。3 CDK4为miR-122的靶基因。通过双荧光素酶报告基因检测,miR-122抑制剂引起相对荧光值与对照组相比,是明显上调的(p=0.003),而miR-122模拟剂则引起相对荧光值的下调(p<0.05)。因此可以确认CDK4为miR-122的靶基因。4找到了一条miR-122调节细胞凋亡的通路:miR122可增加PSMD10降解而引起PSMD10表达的下调(可能与CDK4下调表达有关),进而导致肝癌细胞的凋亡增加,即对化疗药物的敏感性增强。