研究背景骨质疏松是以骨密度减低和骨组织微结构破坏为主要特征的骨代谢性疾病。随着老龄化社会的加速进展,骨质疏松的发病率逐年增高,骨质疏松性骨折所带来的医疗、照护和经济负担逐渐增加,骨质疏松已逐步成为亟待解决的全球性的临床公共卫生问题。适当强度的运动训练,能够改善骨强度、跌倒风险、跌倒冲击等所有可被改变的骨折风险因素,已成为目前骨质疏松治疗的研究热点,但对于运动防治骨质疏松的作用机制仍在不断探索中。长链非编码RNA,尤其是lncRNA H19已被证实在骨代谢、骨肿瘤等多种骨骼生理及病理过程中发挥了调控作用,其在运动防治骨质疏松中的作用机制仍未完全阐明。本研究采用去卵巢手术制备骨质疏松动物模型,使用渐进式跑台运动进行干预,研究运动对去卵巢小鼠骨密度、骨生物力学等指标的影响。在离体实验中采用机械牵张干预骨髓间充质干细胞并敲低lncRNA H19表达,观察micro RNA、下游通路及成骨分化的改变。进一步对机械敏感蛋白Antxr1的表达进行敲低和过表达,研究机械牵张刺激下,lncRNA H19被Antxr1调控后对成骨分化及下游通路的影响。本研究综合以上实验探索lncRNA H19在机械应力调节成骨分化从而防治骨质疏松过程中的作用机制。研究方法第一部分:运动对去卵巢小鼠骨密度、骨强度的影响1.将C57BL/6雌性小鼠于12周龄时进行去卵巢手术造模,并随机分为4组:假手术组、假手术+运动组、去卵巢组、去卵巢+运动组,每组8只。于16周龄进行为期9周的渐进式跑台运动（正式跑台强度为8-15m/min,60min/d,坡度25°,5d/周）。2.跑台结束后取材,分别取小鼠双侧股骨及胫骨为标本,使用micro CT检测骨密度（骨小梁、骨皮质及全骨）、骨小梁体积、骨小梁厚度;使用万能机检测最大载荷、断裂载荷、挠度及弹性模量;采用石蜡切片及HE染色进行骨形态学检测;采用RT-PCR及Westen Blot技术检测骨组织中lncRNA H19、成骨标记物及Wnt/β-Catenin信号通路的表达变化。第二部分:机械牵张对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响和lncRNA H19的调控作用1.检测不同牵拉强度对成骨分化的影响。提取C57BL/6小鼠的原代骨髓间充质干细胞进行培养,采用Flexcell-5000牵张系统对细胞进行机械牵张,分别进行变形强度4%,2h、4h、6h、8h和变形强度6%,2h、4h、6h、8h机械牵张,检测成骨指标和lncRNA H19的表达。2.敲低lncRNA H19后,采用上一步实验得出的最佳方案进行机械牵张干预,观察机械牵张对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,检测Wnt/β-Catenin信号通路、成骨标记物及lncRNA H19的潜在下游mi R-141、675、188、22表达变化,研究lncRNA H19在机械牵张促进成骨分化过程中的作用机制。第三部分:敲低和过表达Antxr1对lncRNA H19和骨髓间充质干细胞成骨分化的影响1.敲低Antxr1在骨髓间充质干细胞中的表达后进行机械牵张,检测lncRNA H19、Wnt/β-Catenin信号通路及成骨标记物的表达,研究Antxr1对lncRNA H19的调控作用和对成骨分化的影响。2.过表达Antxr1后对骨髓间充质干细胞进行机械牵张,检测lncRNA H19、Wnt/β-Catenin信号通路及成骨标记物的表达,进一步研究Antxr1对lncRNA H19的调控作用和对成骨分化的影响。研究结果第一部分1.Micro CT检测结果显示与假手术组相比,去卵巢组小鼠骨小梁体积百分数、骨小梁厚度及骨小梁数量显著降低,骨小梁、骨皮质及全骨骨密度显著下降。去卵巢+运动组的上述指标与去卵巢组相比显著增加,表明运动可以增加小鼠骨密度,改善去卵巢带来的骨密度减低。2.采用三点弯曲实验进行骨生物力学检测,去卵巢组小鼠股骨的最大载荷、断裂载荷和挠度均较假手术组显著降低,去卵巢+运动组的上述指标显著增加,表明运动可以改善去卵巢小鼠骨生物力学性能。3.HE染色结果表明去卵巢组小鼠骨小梁数量减少,脂肪细胞增多。假手术+运动组及去卵巢+运动组与相应假手术组相比骨小梁增多,脂肪细胞显著减少。4.对骨组织标本进行RT-PCR及Westen Blot检测,去卵巢组小鼠骨骼标本中lncRNA H19、Wnt1、β-catenin和成骨标记物OCN、Runx2、OSX的表达减低,运动组的上述指标较相应假手术组相比表达增加;Antxr1在去卵巢组小鼠中表达增加,在运动组小鼠中表达减低。第二部分1.RT-PCR及Westen Blot检测表明lncRNA H19及成骨标记物OCN、Runx2表达随机械牵张强度增大而增加,但牵张变形强度大于4%6h/d和6%4h/d时,成骨作用将不再继续增加。本实验中促进骨髓间充质干细胞成骨分化的最佳牵张方案为6%变形强度,单次牵张时间4h,频率0.5Hz,持续牵张7天。2.机械牵张使骨髓间充质干细胞中lncRNA H19表达增加,mi R-141、675、188表达降低;敲低lncRNA H19后,上述micro RNA表达显著增高;敲低lncRNA H19并进行机械牵张使其表达减低。表明机械牵张通过促进lncRNA H19表达,抑制mi R-141、675、188水平。3.敲低lncRNA H19后,Wnt1、β-catenin、成骨标记物OCN和Runx2表达减低,ALP活性降低;敲低并进行机械牵张使上述指标及lncRNA H19表达增加,ALP成骨活性增强。第三部分1.机械牵张使Antxr1表达增加,敲低Antxr1表达后,RT-PCR及Westen Blot检测表明lncRNA H19、Wnt1、β-catenin、成骨记物OSX、Runx2表达增加,ALP活性增加;敲低Antxr1并机械牵张使Antxr1及成骨标记物的表达增加。2.过表达Antxr1后,RT-PCR及Westen Blot检显示lncRNA H19、Wnt1、β-catenin、成骨记物OSX、Runx2表达减低,ALP活性降低;过表达并进行机械牵张使lncRNA H19、Runx2表达增加,ALP活性增加。结论1.中等强度的渐进式跑台运动能够通过促进骨形成而增加C57BL/6去卵巢小鼠的骨密度和骨生物力学性能并增加骨组织中lncRNA H19表达,有效防治绝经后骨质疏松。2.机械牵张刺激促进骨髓间充质干细胞成骨分化,牵张方案以6%变形强度、4h/d、0.5Hz、持续牵张7天为最佳。机械牵张抑制mi R-141、675、188表达,lncRNA H19负向调控上述micro RNA并通过正向调节Wnt/β-Catenin信号通路而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。3.Antxr1能够正向响应机械牵张刺激,并负向调控lncRNA H19的表达和骨髓间充质干细胞成骨分化,其机制与负向调节Wnt/β-Catenin信号通路有关。