论文部分内容阅读
目的:本实验利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术靶向沉默HOXA10基因,研究靶向沉默HOXA10基因联合中药川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对K562/ADM细胞多药耐药的影响以及机制的探讨,为临床逆转白血病多药耐药提供坚实的实验依据。方法:1、根据筛选出的HOXA10 siRNA构建特异性pGPHI/GFP/Neo-HOXA10 shRNA,应用酶切电泳法、测序法进行重组质粒载体测定,重组质粒稳定转染K562/ADM 细胞,RT-PCR、Western blotting 检测 HOXA10 mRNA 及 HOXA10蛋白表达水平的变化。沉默HOXA10基因后,MTT、FCM分别测定逆转耐药倍数、胞内阿霉素(Adriamycin,Adr)平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI),Western blotting 检测 P-gp、MRP1 蛋白表达量的变化。2、TMP处理K562/ADM细胞,MTT检测TMP逆转耐药倍数,FCM检测胞内Adr MFI,Western blotting检测TMP对P-gp、MRP1蛋白表达水平的影响。3、靶向沉默HOXA10基因联合TMP, MTT检测逆转耐药倍数,FCM检测胞内Adr MFI变化,Western blotting检测不同浓度TMP处理K562/ADM细胞24h后,P-gp、MRP1蛋白表达变化。结果:1、经酶切测定及测序显示重组质粒表达载体构建成功,pGPHI/GFP/Neo-HOXA10 shRNA 重组质粒在 K562/ADM 细胞稳定表达,HOXA10 mRNA及蛋白的相对表达量分别为(38.6±5.95)%和(21.45±1.143)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);靶向沉默HOXA10基因逆转.耐药倍数为2.05,胞内AdrMFI升至(315.33±3.511),稳定表达pGPHI/GFP/Neo-HOXA10 shRNA 载体的 K562/ADM 细胞 P-gp、MRP1 相对表达量分别为(35.74±6.34) %、(39.43±3.144) %,均低于空白对照组、阴性对照组,与对照组比较,差异有统计学意义。2、1μg/mlTMP的细胞抑制率为(2.1434±0.17263),2μg/mlTMP细胞抑制率为(8.6034±0.33859)%, 1μg/ml、2μg/mlTMP 逆转耐药倍数分别为 1.15、1.27,胞内 AdrMFI 分别为(237±2.57)、(273.33±4.509),2μg/mlTMP 逆转效果明显高于 1μg/mlTMP (P<0.05),2μg/mlTMP 组 K562/ADM 细胞 P-gp、MRP1表达水平明显低于1μg/mlTMP组(P<0.05)。3、HOXA10 RNAi+TMP组逆转耐药倍数、胞内Adr MFI分别为5.08、(454.33±6.11),均高于 HOXA10RNAi 组以及 TMP 组,P-gp、MRP1 的相对表达量为(19.85±8.347) %、(20.44±3.311) %,显著低于 HOXA10RNAi、TMP组,与对照组比较,差异有统计学意义。结论:1、成功构建的pGPHI/GFP/Neo-HOXA10 shRNA表达载体能有效抑制HOXA10基因、HOXA10蛋白的表达,靶向沉默HOXA10基因、TMP均能逆转K562/ADM细胞MDR,TMP逆转K562/ADM MDR呈剂量依赖性。2、靶向沉默HOXA10基因联合TMP逆转耐药的效果显著高于靶向沉默HOXA10基因、TMP的逆转耐药效果,具体机制为通过抑制P-gp、MRP1表达,提高Adr胞内蓄积浓度,增强Adr的细胞毒作用,进而逆转K562/ADM细胞MDR。