十足目甲壳动物是重要的水产养殖品种,可创造巨大的经济价值。但水产养殖业长期遭受病害侵袭,研究其免疫防御机制,尤其是病原识别机制对于疾病防治具有重要意义。C型凝集素是甲壳动物中一种重要的病原识别分子,且大量表达,但目前关于其功能研究很少。为了阐明它们在针对病原时的具体作用,并研究该家族是否具有特异性,本研究选取对虾和克氏原螯虾为实验动物,研究C型凝集素在其免疫系统中的作用,主要是病原识别和识别后的下游免疫反应以及C型凝集素家族的多样性。1.中国明对虾C型凝集素3(FcLec3)作为病毒受体参与抗病毒免疫反应我们在中国明对虾中发现了一种新的C型凝集素命名为FcLec3。FcLec3的cDNA全长为739bp,其中开放阅读框为474bp,编码一个含158个氨基酸残基的蛋白,其中信号肽长17个残基,另外含有一个C型凝集素样结构域。FcLec3特异性分布于肝胰腺的纤维细胞中。在受到鳗弧菌刺激后,FcLec3表达量会上升,然后恢复至正常水平；在受到白斑病毒刺激后,表达呈现出先上升再下降再上升的趋势。FcLec3重组蛋白可以在钙离子存在的情况下凝集细菌,并且该凝集活性能够被麦芽糖、N乙酰化的甘露糖胺、肽聚糖和胞壁酸抑制,说明该蛋白可以结合这些糖类。另外,我们还发现,FcLec3可以结合白斑病毒的最主要囊膜蛋白VP28,说明其发挥病毒受体的作用。2.中国明对虾C型凝集素4(FcLec4)作为调理素促进吞噬作用我们在中国明对虾中鉴定得到一条C型凝集素,命名为FcLec4。FcLec4含有信号肽和一个C型凝集素样结构域。尽管来自于甲壳动物,FcLec4与来自于昆虫中的凝集素相似度更高。FcLec4与大部分甲壳动物C型凝集素不同,其分布较为广泛,在鳃、胃、肝胰腺和肠中均可检测到。受到鳗弧菌刺激后,FcLec4在转录和翻译水平上均会上调表达,并且在合成后被释放至循环系统中发挥作用。FcLec4可以凝集多种革兰氏阳性和阴性细菌,结合肽聚糖,并且可以选择性地紧密结合于几种微生物表面。在结合鳗弧菌后,FcLec4可以在对虾体内促进机体对鳗弧菌的清除作用。另外,我们还在日本囊对虾中发现了FcLec4的同系物,该同系物与FcLec4的序列相似性达到94%,并且具有和FcLec4相似的表达模式。我们纯化了FcLec4的天然蛋白,发现其同样可以结合于鳗弧菌表面,并且在日本囊对虾体内加快机体对细菌的清除速率,并且这种作用不只局限于鳗弧菌,还可针对数种其他细菌。FcLec4天然蛋白还可在体内结合于日本囊对虾血细胞表面,说明其作为一种调理素,在识别病原后,促进血细胞对病原菌的吞噬作用。3.克氏原螯虾C型凝集素2(PcLec2)诱导酚氧化酶激活系统的活化通过对克氏原螯虾cDNA文库进行测序和分析,我们得到了一条C型凝集素PcLec2,其含有一个长为131氨基酸残基的C型凝集素样结构域。PcLec2特异性地分布于肝胰腺中,在受到脂多糖和细菌刺激后,表达量会明显上调,说明其可能参与了螯虾的抗细菌免疫。尽管PcLec2重组蛋白不能凝集细菌和抑制其生长,但可以在不依靠钙离子的情况下结合于细菌表面,并且钙离子可以增强结合活性；另外,PcLec2还可以结合脂多糖,但钙离子并不能发挥作用。PcLec2还可以在体外和体内诱发酚氧化酶激活系统的活化,并且可在体内增强由细菌引发的激活作用。4.日本囊对虾中C型凝集素表现出了序列多样性和病原相对特异性通过对日本囊对虾进行转录组测序,我们共发现了31条可能的C型凝集素。通过对它们的序列信息进行分析发现,对维持其C型凝集素样结构域结构重要的氨基酸残基如形成两对二硫键的半胱氨酸、参与疏水核心形成的氨基酸等较为保守,而对底物结合比较重要的残基显得有较多变化,这种现象可能导致了C型凝集素功能的多样性。大多数C型凝集素主要分布于肝胰腺和血细胞中；于肝胰腺中高表达的C型凝集素更倾向于组织特异性分布,而于其他组织中高表达的C型凝集素更倾向于广泛分布。在受到鳗弧菌刺激后,有21个基因表达出现明显变化,大多数在感染早期作用(6小时)。肝胰腺中最高表达的基因在细菌刺激后为上调表达,而在血细胞中最高表达的基因为下调表达。在受到白斑病毒刺激后,有13个凝集素表达出现明显变化,其中7个发生在感染早期,另外6个凝集素在感染后中晚期(24-48小时)表达模式发生变化。实验发现,甲壳动物中存在大量C型凝集素,具有多种功能。C型凝集素不仅表现出了结构多样性,还具有一定的病原特异性。这些结果为讨论无脊椎动物C型凝集素大量存在的意义及先天免疫的“特异性”提供了基础。