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目的在实体瘤治疗中,靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor,CAR-T)会造成脱靶毒性。CAR-T细胞的单链可变区(single-chain variable fragment,scFv)在靶细胞特异识别中发挥关键作用,目前,降低scFv亲和力已经成为消除CAR-T细胞脱靶毒性的有效策略,但是,亲和力降低可能会影响CAR-T细胞的抗肿瘤活性。人类表皮生长因子受体2(HER2)是跨膜表皮生长因子受体家族的成员,在多种肿瘤细胞表面呈高水平表达,是CAR-T细胞治疗的靶点之一。本研究选择了2种在临床试验中应用但是亲和力不同的HER2特异性scFv作为CAR-T细胞的胞外识别域,旨在探究在具有较好治疗安全性的前提下,scFv亲和力大小对CAR-T细胞抗肿瘤能力的影响。方法利用分子克隆技术构建CAR慢病毒表达质粒,使用293T细胞进行病毒制备后对健康供者外周血来源的CD8~+T细胞进行基因转导,获得不同亲和力且特异性靶向HER2的FRP5-CAR-T细胞(低亲和力)和ch A21-CAR-T细胞(高亲和力),之后使用流式细胞术检测基因转导效率;为了解scFv亲和力对CAR-T细胞增殖和分化的影响,在体外培养过程中,分别采用细胞计数和流式细胞术在不同时间点进行检测;利用流式细胞术检测细胞系表面HER2的表达情况,筛选出HER2高表达的MCF-7和低表达的MRC-5细胞系;分别将MCF-7和MRC-5细胞与不同CAR-T细胞共孵育后利用生物发光法(Bioluminescence imaging)检测杀伤效率;收集细胞共孵育上清,使用酶联免疫吸附(ELISA)实验检测IL-2和IFN-γ的分泌情况;使用成像流式细胞仪检测CAR-T细胞与靶细胞共孵育后免疫突触形成能力;采用免疫印迹(Western Blot)法检测CAR-T细胞激活后相关信号通路改变情况;开展动物实验验证scFv亲和力对CAR-T细胞在体内抗肿瘤能力的影响。结果1.成功构建了两种不同亲和力的CAR慢病毒表达载体。2.成功获得两种不同亲和力的CAR-T细胞。且在体外培养过程,不同亲和力的scFv对CAR-T细胞增殖和分化没有显著影响。3.流式细胞术检测结果显示,MRC-5为HER2低表达细胞系,MCF-7为HER2高表达细胞系。CAR-T细胞与MRC-5细胞共孵育结果显示,表达低亲和力scFv的CAR-T细胞不会产生脱靶毒性。CAR-T细胞与MCF-7细胞共孵育结果显示,较高亲和力ch A21-CAR-T细胞分泌更高水平的IL-2和IFN-γ。成像流式检测显示:ch A21-CAR-T细胞形成免疫突触的能力更强。免疫印迹结果进一步显示:ch A21-CAR-T细胞中活化信号通路的蛋白表达水平更高。动物实验结果显示:ch A21-CAR-T细胞在体内能够更好地抑制肿瘤生长。结论本研究分析了scFv亲和力对CAR-T细胞抗肿瘤能力的影响。研究结果表明,高亲和力scFv作为CAR-T细胞的胞外识别域可以提高CAR-T细胞的细胞因子分泌、免疫突触形成能力和T细胞活化信号水平,进而增强CAR-T细胞的抗肿瘤能力。