青蒿内生菌的分离及其抑菌活性研究

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植物内生菌(endophyte)是指生长在健康植物组织、器官内部,不造成明显症状的正常微生物,并可以从经过表面消毒的植物内部分离得到。植物内生菌是一个十分丰富的类群,而抗菌内生菌作为其中的一类,能够产生很多新的抗菌活性物质,不但可以用于医疗上新药的研发,还可以用于农业植物病害的防治。传统的药用植物作为一类新的内生菌来源材料,正在成为内生菌研究者争相研究的对象。本文选择了青蒿(Artemisia annus L)作为内生菌的分离材料,分离、筛选抗菌微生物,并对其抑菌活性菌株进行了进一步研究。以菊科植物青蒿的根、茎、叶为材料,从中分离出了内生菌67株,其中细菌43株,真菌16株,放线菌8株;以棉花枯萎、小麦赤霉、番茄叶霉等8种病原真菌做为靶标菌,研究了青蒿内生菌的抗菌活性,筛选出了抗菌活性较高的1株内生真菌。对具有较高抗菌活性的内生真菌G2进行了分子鉴定。用CTAB法提取基因组DNA,用真菌通用引物NS1、ITS4采用PCR技术扩增真菌的部分rDNA,纯化后测定其序列,所得序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索,并和其中标准株的rDNA序列进行序列比对,结果表明菌株G2为半知菌亚门的炭疽菌属(Colletetrichum)真菌。对具有较高抗菌活性的内生真菌G2进行液体培养,将其发酵产物离心后得到发酵液和菌丝体。菌丝体烘干研磨后用95%乙醇水浴提取,乙醇提取液浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇与等体积的水萃取,将得到的各相萃取物和发酵液浓缩物进行抑菌活性测定和化学成分定性检测。结果表明其菌丝体乙醇提取物的正丁醇萃取物相对各种病原真菌都有很好的抑制作用,水相萃取物对各种病原真菌都没有明显的抑制作用,其它各相萃取物只对某几种病原真菌有较强的抑制作用。以基础发酵培养基为基质,分别加入不同的碳源、氮源、生长因子和无机盐,对青蒿内生真菌G2进行液体培养,对其抑菌活性成分的最优发酵条件进行了初步研究,分别根据液体培养所得菌丝体的生物量及菌丝体提取物的抑菌活性得出G2液体培养的最优碳源、氮源、生长因子和无机盐。结果表明:分别以两种不同的指标所获得的最佳营养基配方不存在一定的联系。以菌丝体提取物的抑菌活性为指标,所获得的最佳培养基配方为:最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为豆饼粉,最佳生长因子为维生素B1,最佳无机盐为硫酸亚铁。青蒿内生真菌G2的抑菌活性成分的结构还有待进一步研究。
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