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宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一,占女性生殖器官恶性肿瘤总数的半数以上。放射治疗是宫颈癌的主要治疗方法之一。但临床资料显示,宫颈癌的放疗效果仍然有限。研究发现,辐射抗性癌细胞的存在是宫颈癌患者放疗后出现复发和转移的主要原因。因此,明确调控宫颈癌辐射抵抗的关键分子和调控途径,对于提高宫颈癌放疗效果意义重大。多种信号通路,如NF-κB、PI3-K/Akt及TGFβ等通路,及多种关键分子,如HIF-1、p53、p21等,已被报道参与了宫颈癌细胞的辐射敏感性的调控。宫颈癌辐射敏感性调节机制是涉及多因素、多步骤的复杂生物学过程,目前的研究尚未完全阐明,故有待于进一步研究。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在肿瘤转移中具有非常重要的作用,它被认为是肿瘤细胞获得侵袭转移能力的关键机制之一。EMT可使肿瘤细胞的侵袭转移能力显著增强。因此,深入研究肿瘤发生EMT的分子机制及相关重要调控因子,并对关键通路的关键分子进行干预,理论上可以有效抑制肿瘤的转移。microRNAs(miRNAs)是一类新的调控因子,参与调控众多生物学过程,在机体的生长发育、疾病发生以及肿瘤的发生发展中都具有重要作用。研究发现,miRNAs在调控宫颈癌的辐射抗性及侵袭转移中也发挥重要作用。本文从miRNA角度探寻宫颈癌辐射抵抗及侵袭转移的作用与机制,以期寻找关键作用的miRNA分子,将其作为潜在治疗靶点,从而提高放疗疗效。研究目的:1.建立辐射抗性宫颈癌细胞株并筛选抗性细胞中差异表达的mirnas。2.验证mir-630对宫颈癌hela细胞辐射抗性的调控作用。3.研究mir-630对宫颈癌hela细胞emt的影响。研究方法:1.模拟临床肿瘤放射治疗的分割疗法,2gyγ射线连续照射宫颈癌hela、siha细胞建立辐射抗性宫颈癌细胞株。mirna芯片技术筛选辐射抗性细胞与亲本细胞中差异表达的mirnas。2.人宫颈癌hela细胞分别经不同剂量的co60γ射线照射,借助qrt-pcr检测辐照后hela细胞中mir-630的表达水平。hela细胞经6gyγ射线照射后不同时间点,采用qrt-pcr检测mir-630的表达水平。3.制备mir-630的慢病毒表达载体,包括上调mir-630的载体lentivirus-hsa-mir-630,下调mir-630的载体lentivirus-hsa-mir-630-inhibition,以及空载体lentivirus-negativecontrol,并感染hela细胞,利用puromycin进行稳定感染细胞筛选。通过qrt-pcr鉴定调变mir-630表达的hela细胞株。4.以调变mir-630表达的hela细胞作为研究模型,采用6gy和8gyγ射线照射,借助mtt法检测辐照后3、5、7天的细胞活性;利用克隆形成实验观察细胞辐照后的细胞克隆形成能力;采用流式细胞术检测自发凋亡及辐射诱导的细胞凋亡;并利用westernblot检测细胞辐照前后凋亡相关蛋白bax,bcl-2,caspase3,caspase7及caspase9的表达水平。5.移植瘤实验观察调变mir-630表达的hela细胞株的致瘤性。6.借助划痕实验,rtca细胞迁移实验和transwell侵袭实验,来观察mir-630调变对宫颈癌hela细胞转移和侵袭能力的影响,采用westernblot实验检测emt相关标志物e-cadherin、cytokeratin及n-cadherin在mir-630调变表达的hela细胞株中的表达。7.双荧光素酶报告基因实验验证mir-630的靶基因。8.不同乏氧条件处理宫颈癌hela细胞后通过qrt-pcr检测细胞中mir-630的表达水平。实验结果:1.成功建立辐射抗性宫颈癌细胞株Hela-R11及Siha-R15,在辐射抗性细胞中miR-630表达显著上调。2.辐射可诱导宫颈癌Hela细胞中miR-630表达上调,并具有剂量和时间依赖性。3.成功建立稳定调变miR-630的宫颈癌Hela细胞株。4.miR-630可增强辐射后宫颈癌Hela细胞的活性及克隆形成能力,降低细胞的自发凋亡及辐射诱导的细胞凋亡,miR-630亦可增强抗凋亡蛋白Bcl-2表达,同时抑制促凋亡蛋白Bax,Caspase 3,Caspase 7 and Caspase 9表达。5.miR-630可增强宫颈癌Hela细胞的致瘤性。6.miR-630可增强Hela细胞侵袭转移能力,同时通过降低上皮标志物E-cadherin和Cytokeratin的表达、升高间质标志物N-cadherin的表达来诱导EMT发生。7.miR-630对ZNF-451和IGF1R基因无直接调控作用。8.乏氧可快速诱导Hela细胞中miR-630表达上调,并长时间维持miR-630的高表达水平。结论:辐射和乏氧可诱导miR-630在宫颈癌Hela细胞中表达。miR-630可通过抑制辐照诱导的细胞凋亡增强宫颈癌Hela细胞的辐射抗性。miR-630可诱导宫颈癌Hela细胞发生EMT从而促进Hela细胞的侵袭转移。