随着经济的不断发展,现代化工原料中许多污染物对人类及动物的生存环境造成了潜在的威胁。如双酚A(Bisphenol A,BPA)和邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP),二者被广泛应用于塑料行业,如水杯、婴儿奶瓶、饭盒、包装袋和玩具等等。BPA和DEHP,有研究发现二者是内分泌紊乱物,这些内分泌紊乱物干扰着内分泌系统的正常功能,同时还跟几种疾病的发生有着密切的联系,如不孕不育症等。在研究DEHP的同时,相关实验还研究了其在体内的代谢路径,DEHP通过各种途径进入机体后,其主要代谢产物包括活性中间产物邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯(MEHP)产物和2-乙基-1-己醇(2-ethylhexanol),其中代谢产物MEHP也可能会对机体产生一定的毒性作用。BPA和DEHP被认为是内分泌物干扰物(Endocrine disrupting chemical,EDCs),所以研究BPA和DEHP对体外猪卵母细胞成熟的毒性作用和可能性机制,能够为临床疾病提供理论依据。本实验以猪为试验对象,采用的方法有体外培养、药物处理、孤雌激活、免疫荧光染色、活性氧生成测定、膜联蛋白染色(Annexin-V)、荧光定量PCR(Real-timePCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)等。首先通过药物处理,观察猪卵母细胞周围颗粒细胞的扩散情况,且测定第一极体(firstpolarbody,pbI)排出率来判断内分泌紊乱物的影响。随后通过激光共聚焦显微镜观察,统计培养44h及60h后猪卵母细胞的细胞周期(cell cycle),来判定内分泌干扰物是否具有延缓细胞周期的作用。通过荧光染色来观察,内分泌干扰物是否影响了微管的组装,通过Image J分析微丝的荧光强度,判定微丝的表达是否受影响。通过Western blot方法,从蛋白的角度进一步检测内分泌干扰物是否影响MAPK的磷酸化水平和LC3的表达水平。通过免疫荧光染色观察,内分泌干扰物是否改变了 DNA甲基化及组蛋白甲基化水平,同时通过Real-time PCR方法进一步从基因的角度分析其变化趋势。有研究发现氧化应激会引起细胞的早期凋亡和自噬效应,因此我们检测了 ROS的表达水平及早期凋亡和自噬水平。直至目前,仍然只有很少有关EDCs影响猪卵母细胞成熟的研究,尤其是毒性机制。因此本试验的目的是研究BPA、DEHP及其代谢产物MEHP对猪卵母细胞体外成熟的影响。本实验共分两部分,主要研究结果如下所示:试验一、BPA对猪卵母细胞体外成熟的影响及可能性的毒性机制。实验结果如下所示:1.体外处理猪卵母细胞,BPA处理导致卵母细胞的成熟率显著下降。其原因可能是因为BPA延缓了卵母细胞的细胞周期,从而影响卵母细胞的成熟率。2.与对照组相比,BPA体外处理导致猪卵母细胞细胞骨架异常,具体体现在染色体的排列、纺锤体的构型以及微丝的表达水平等方面。与此同时,为了进一步验证我们的试验结果,我们又通过Western blot方法检测了 p-MAPK水平,结果p-MAPK蛋白表达量显著下降。3.通过免疫荧光强度分析,结果显示,BPA处理后的猪卵母细胞,其DNA甲基化水平(5mC)和组蛋白甲基化水平(histonemethylation,H3K4me2)被改变,由此可以证明BPA处理导致猪卵母细胞的表观遗传修饰水平被改变。4.我们同时也发现BPA曝光导致猪卵母细胞有很高的早期凋亡和自噬水平,究其原因,可能是由于氧化应激水平被改变而导致的,为进一步验证其结果,通过Western blot方法检测了 LC3蛋白的表达水平,结果显示LC3水平显著增加,同时也验证了 BPA可以导致猪卵母细胞早期凋亡。终上所述,我们的实验结果证明了 BPA处理影响了猪卵母细胞的成熟,通过影响细胞骨架形态学,早期凋亡和自噬及表观遗传修饰水平来发挥其毒性作用。试验二、DEHP及其代谢产物MEHP对猪卵母细胞体外成熟的影响及可能性机制。试验结果如下:1.DEHP体外处理猪卵母细胞,结果显示不影响其颗粒细胞的扩散,同时也不影响猪卵母细胞的成熟率。2.MEHP是DEHP的活性代谢产物,MEHP体外培养猪卵母细胞,观察到MEHP不仅影响了颗粒细胞的扩散情况,同时也显著降低了猪卵母细胞的成熟率。其原因可能是由于MEHP延缓了猪卵母细胞的细胞周期,从而降低了猪卵母细胞的成熟率。3.与对照组相比,MEHP导致猪卵母细胞的细胞骨架异常率显著增加,包括微丝的表达、纺锤体的构型、染色体的排列等。4.通过免疫荧光强度分析,结果显示,MEHP处理导致猪卵母细胞的DNA甲基化(5mC)和组蛋白甲基化(H3K4me2)水平被改变,由此可以证明MEHP处理改变了猪卵母细胞的表观遗传修饰水平。5.同时MEHP处理会导致猪卵母细胞早期凋亡和自噬,可能是由于氧化应激水平被改变而导致。为进一步验证其结果,通过Western blot方法,结果显示LC3蛋白的表达量显著增加。终上所述,我们的实验结果证明了 MEHP体外处理猪卵母细胞导致卵母细胞成熟率降低。其原因可能是MEHP影响了猪卵母细胞细胞骨架动态过程,表观遗传修饰水平、氧化应激所导致的早期凋亡和自噬水平被改变。