【摘 要】
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目的:构建睫状神经营养因子(CNTF)基因和绿色荧光蛋白(GFP)共表达的腺相关病毒载体,获得高效的腺相关病毒转基因平台。方法:设计与合成CNTF蛋白编码区两端的引物,高保真酶扩
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目的:构建睫状神经营养因子(CNTF)基因和绿色荧光蛋白(GFP)共表达的腺相关病毒载体,获得高效的腺相关病毒转基因平台。方法:设计与合成CNTF蛋白编码区两端的引物,高保真酶扩增CNTF蛋白编码区序列。采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法,将CNTF基因插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP中,构建CNTF和GFP共表达的腺相关病毒载体(pAAV-CNTF-IRES-hrGFP)。在脂质体介导下,与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-AAV-293细胞,包装产生腺相关病毒(rAAV-CNTF);收集病毒颗粒,感染体外培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)。荧光显微镜下观察GFP的表达。结果:1. pAAV-CNTF-IRES-hrGFP质粒通过PCR法和SalⅠ/BamHⅠ双酶切分析鉴定,结果表明插入目的DNA片段与预期结果一致,进一步DNA测序结果表明插入片段为CNTF目的基因,且其DNA序列和读码框正确。2.三质粒共转染AAV-293细胞后,荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。提取病毒基因组经PCR证实病毒携带CNTF基因。3.带有CNTF的重组腺相关病毒可有效感染体外培养的人RPE。结论:成功构建了pAAV-CNTF-IRES-hrGFP质粒,包装、制备了高滴度的rAAV-CNTF病毒。获得的重组病毒可有效感染RPE。
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