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β细胞功能衰竭是2型糖尿病晚期一个重要的特征,高糖诱导的细胞凋亡是胰岛β细胞功能衰竭一个重要原因。深入研究高糖诱导胰岛β细胞凋亡的分子机制对阐明2型糖尿病的发生和发展机制以及对糖尿病的防治都具有重要的意义。线粒体分裂蛋白(Dynamin-related protein 1, Drp-1)是参与线粒体分裂的主要分子,凋亡早期线粒体出现明显的分裂过程增强,高糖可上调Drp-1基因的表达,但Drp-1基因表达与高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的关系尚未见报道。目的:研究线粒体分裂蛋白(Dynamin-related protein 1, Drp-1)的表达对高糖诱导胰岛β细胞凋亡的影响,探讨线粒体分裂与β细胞凋亡的分子机制。方法:1)构建Drp-1和Drp-1K38A质粒,.应用基因转染技术在大鼠胰岛β细胞(INS-1)构建表达Drp-1野生型(Drp-1WT)和Drp-1突变型(Drp-1K38A)基因的可诱导细胞系,并用细胞免疫荧光和实时定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)方法证实转染基因的可诱导性.,采用免疫蛋白印迹(Western blot)分析Doxycycline(Dox)诱导后胰岛β细胞Drp-1表达的时-效关系和量-效关系,确定Dox的最佳作用剂量和作用时间。2)分析高糖条件下Drp-1基因的表达,.以及Drp-1的表达对胰岛β细胞增殖的影响;Real-time PCR和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassy,ELISA)分析Drp-1表达对胰岛素mRNA的表达和胰岛素释放的影响。应用生物化学的方法分析Drp-1表达对胰岛β细胞能量代谢的影响。应用AnnexinⅤ-PI、Hochest33342-PI、TUNEL染色及DNA Ladder分析在高糖条件,.Dox诱导前后胰岛β细胞凋亡的情况。3)应用免疫蛋白印迹(Western blot)方法比较不同糖浓度时,Dox诱导前后Drp-1的表达和细胞色素c的释放相关性。应用微孔板式连续荧光光谱仪测定不同条件下细胞内凋亡蛋白酶Caspase3的活性。应用透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察Dox诱导前后线粒体的形态变化并在共聚焦显微镜下分析细胞色素c在细胞内的分布。应用流式细胞术比较Dox诱导前后细胞线粒体膜电位的变化和细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的产生。结果:1)Drp-1可诱导细胞系的鉴定:免疫荧光和Western blot的结果显示,Dox诱导后Drp-1基因表达在野生型(Drp-1WT)和突变型(Drp-1K38A)细胞系表达明显增加,并且Drp-1的表达与Dox之间存在明显的剂量—依赖和时间—依赖关系,500ng/ml Dox诱导24h后,Drp-1的表达即明显增加,96h达高峰。2)Drp-1表达对胰岛β细胞功能的影响:MTT结果显示:Dox诱导后,细胞增殖和胰岛素分泌能力在Drp-1WT细胞明显降低,而在Drp-1K38A细胞变化不大,这种现象在高糖培养条件时更明显。能量代谢的实验结果显示:在高糖条件下,Drp-1WT细胞在Dox诱导后的呼吸酶复合体活性明显升高,ATP含量减少。凋亡的分析结果表明:在高糖条件下,经Dox诱导后Drp-1WT细胞的凋亡明显多于Drp-1K38A细胞。3)Drp-1表达参与胰岛β细胞凋亡的机制:透射电镜和激光共聚焦显微镜观察发现:在高糖条件下,Dox诱导后的Drp-1WT细胞中的可见线粒体分裂和细胞色素c的释放。生物学分析结果表明:细胞中的线粒体膜电位降低、caspase3活性升高、ROS产生增加,而这些变化在Drp-1K38A细胞变化不明显。结论:Drp-1基因表达参与高糖诱导的胰岛β细胞凋亡。