论文部分内容阅读
C型钠钛(C-type Natriuretic Peptide,CNP)作为利钠家族成员之一,是一种生理性多肽,其能够维持卵母细胞减数分裂阻滞状态且对卵母细胞的毒性较低。犬卵巢成熟卵泡中排出的卵母细胞需要在输卵管成熟2-5d才排出第一极体,这与牛羊等物种成熟卵泡中排出的卵母细胞已经排出第一极体有所不同。这一生理差异,导致借鉴牛羊等物种的卵母细胞体外成熟培养体系发展而成的犬卵母细胞体外成熟效果并不理想,成为制约犬辅助生殖技术发展的瓶颈。本文利用实时荧光定量技术检测利钠家族主要成员及其受体在不同时期犬卵巢、壁层颗粒细胞(Parietal Grannular Cell,PGC)以及卵丘细胞(Cumulus Cell,CC)的表达水平,并进一步筛选犬卵母细胞体外成熟培养液中添加CNP的适宜浓度和处理时间,及CNP对犬卵母细胞体外成熟效果的影响,旨在探索一种提高犬卵母细胞体外成熟效果的方法。经过研究,CNP在卵巢的卵泡期、黄体期和乏情期的m RNA表达量极显著高于脑钠钛(Brain Natriuretic Peptide,BNP)(P<0.01),显著高于心钠钛(Atrial natriuretic peptide,ANP)(P<0.05);受体 NPR1(Natriuretic Peptide Receptor 1,NPR1)和NPR2(Natriuretic Peptide Receptor 2,NPR2)在卵巢的卵泡期的 m RNA 表达量均极显著高于乏情期(P<0.01),其中NPR2在卵巢卵泡期、乏情期和黄体期的m RNA的表达量均高于NPR1(P<0.01);CNP在PGC中的m RNA表达量显著高于CC(P<0.05),然而NPR2在CC中的m RNA表达量显著高于PGC(P<0.05)。用不同浓度CNP(50,100,500,1000nmol/L)分别处理犬卵母细胞6,12,18,24h(第一步成熟),然后转入常规成熟液中补足72h(第二步成熟),筛选添加CNP的适宜浓度和处理时间,结果显示:100nmol/L的CNP处理12h,然后转入常规培养液中补足72h的效果为最佳。利用最佳方法(CNP组)和常规方法(对照组)进行体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)的卵母细胞,以及体内成熟(In Vivo Maturation,IVV)(体内组)的犬卵母细胞,分别进行孤雌激活(Parthenogenetic Activation,PA)和体外受精(In Vitro Fertilization,IVF),比较其体外发育能力。结果显示:卵母细胞经PA后,CNP组的卵裂率和8-16细胞比率均显著高于对照组(P<0.05),但显著低于体内组(P<0.05);卵母细胞经IVF后,CNP组的卵裂率、8-16细胞比率与对照组无显著性差异(P>0.05),但均显著低于体内组(P<0.05);CNP组4-细胞比率均显著低于体内组(P<0.05),对照组4-细胞比率均极显著极显著低于体内组(P<0.01)。综上所述,CNP在犬卵巢中的mRNA表达量高于BNP和ANP,CNP在PGC中的mRNA表达量高于CC;卵巢中NPR2的mRNA表达量高于NPR1,NPR2在CC中的m RNA表达量高于PGC;犬卵母细胞经100nmol/L的CNP处理12h,然后转入常规培养液中补足72h,是最佳IVM方法。