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第一章SDF-1/CXCR4介导BMSCs修复子宫内膜与内膜纤维化失衡在宫腔粘连发病机制中的研究目的:通过检测宫腔粘连患者子宫内膜ESR1、干细胞、纤维化和内膜容受性指标,探讨宫腔粘连(IUA)形成过程中骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复子宫内膜与内膜纤维化之间的关系;探寻BMSCs在内膜修复中的作用。方法:1.2015.9-2016.2,我院宫腔镜诊治中心接受宫腔粘连手术患者56人(粘连评分≥9分),其中轻中度粘连40人(9-18分),重度粘连16人(≥19分);同期行子宫纵隔手术20人作为对照。在黄体期行激素检测以P>5ng/ml做为纳入指标,年龄18-42岁。收集患者一般资料,B超测量内膜厚度。2.于手术电切前取子宫内膜组织,分别行q RT-PCR、Western Blot(WB)、免疫组化(IHC)检测ESR1,干细胞相关指标SDF-1、CXCR4,纤维化相关指标TGF-β1、MMP-9及子宫内膜容受性指标VEGF、αvβ3 m RNA和蛋白表达情况。结果:1.子宫内膜厚度黄体期检测患者子宫内膜厚度,结果显示各组内膜厚度不同,宫腔粘连患者内膜厚度明显低于对照组,且随粘连程度加重而变薄。2.ESR1各组ESR1表达不同。宫腔粘连患者ESR1表达明显高于对照组,且随粘连程度加重而升高。3.干细胞相关指标SDF-1、CXCR43.1 SDF-1各组SDF-1 m RNA和蛋白表达无明显差异。3.2 CXCR4仅IHC检测重度IUA-对照组中CXCR4蛋白表达不同,重度IUA组CXCR4蛋白表达低于对照组;余各组CXCR4表达无明显差异。4.纤维化相关指标TGF-β1、MMP-94.1 TGF-β1各组TGF-β1表达不同。IUA患者TGF-β1表达明显高于对照组,且随粘连程度加重而升高。4.2 MMP-9各组MMP-9表达不同。IUA患者MMP-9表达明显高于对照组,且随粘连程度加重而升高。5.内膜容受性相关指标VEGF、整合素β3(αvβ3)5.1 VEGF各组VEGF表达无明显差异。5.2 αvβ3仅IHC检测重度IUA-对照组中αvβ3蛋白表达不同,重度IUA组αvβ3蛋白表达低于对照组;余各组αvβ3表达无明显差异。结论:内膜损伤后,宫腔粘连形成过程中内膜修复与纤维化失衡,导致细胞外基质沉积、内膜纤维化;此过程中ESR1升高,内膜纤维化反应激增,而BMSCs对内膜修复机制受抑制,内膜容受性似有下降。第二章雌激素对SDF-1/CXCR4介导的BMSCs子宫内膜修复及内膜纤维化在宫腔粘连治疗中的影响目的:用不同剂量的雌激素(戊酸雌二醇)治疗TCRA术后的宫腔粘连患者,了解不同剂量雌激素对患者下丘脑-垂体-卵巢轴的影响;检测子宫内膜ESR1、干细胞、纤维化和内膜容受性指标,探讨不同剂量雌激素对宫腔粘连患者术后恢复的影响。方法:1.2015.9-2016.2,我院宫腔镜诊治中心宫腔粘连手术患者56人(粘连评分≥9分),其中轻中度粘连40人(9-18分),重度粘连16人(≥19分);年龄18-42岁。2.所有患者均由一人常规行宫腔镜粘连电切术(TCRA),术后宫内置入防粘连膜包裹的圆形金属节育环一枚。术后3月取环。3.分别用戊酸雌二醇4mg(23人)、6mg(17人)和9mg(16人)对TCRA术后患者进行治疗。其中轻中度粘连患者术后接受雌激素治疗,EV 4mg组19例,EV 9mg组9例;重度粘连患者术后接受雌激素治疗,EV 4mg组4例,EV 9mg组7例。于手术后1月、3月行宫腔镜检查评估手术效果。4.术前、术后1月、术后3月黄体期采集患者外周血检测FSH、E2、P,评估患者卵巢功能及排卵情况。5.于手术电切前、术后1月、术后3月取子宫内膜组织,分别行q PCR、Western Blot检测ESR1,干细胞相关指标SDF-1、CXCR4,纤维化相关指标TGF-β1、MMP-9及子宫内膜容受性指标VEGF、αvβ3m RNA和蛋白的表达情况。6.取环后随访3月,了解患者月经及受孕情况。结果:1.一般情况1.1宫腔镜检查情况术后1月复查宫腔再次发生粘连2例,均为重度粘连患者,其中1例即刻行TCRA手术恢复宫腔形态;另1例左宫角粘连封闭,左侧环臂局部嵌顿,镜鞘钝性分离之。术后3月复查除前例左宫角粘连例外无新发宫腔粘连。余宫腔形态恢复正常,环各臂无嵌顿,内膜近覆盖整个创面。1.2激素治疗对卵巢功能的影响EV 4mg组,排卵抑制率为8.69%(2/23);EV 6mg组,排卵抑制率为58.82%(10/17);EV 9mg组,排卵抑制率为93.75%(15/16)。停药后1月内未排卵率:雌激素EV 4mg组为4.34%(1/23);EV6mg组为17.64%(3/17);EV 9mg组为56.25%(9/16)。1.3月经及妊娠情况取环后3个月,除3例月经量无明显改善外,其余53例月经量接近或恢复正常,治疗有效率达94.6%(53/56)。13例取环后3月内妊娠,妊娠率达23.21%(13/56);其中9例为取环术后次月妊娠,4例为取环术后2-3月内妊娠;1例为稽留流产,余均妊娠8周以上,1例正常分娩,无并发症。近期治愈率达23.21%(13/56)(取环后3个月内妊娠)。2.治疗前后ESR1变化治疗后ESR1表达明显下降。重度IUA组、轻中度IUA组、EV4mg组和EV 9mg组前后对照差异均有统计学意义。3.治疗前后干细胞相关指标SDF-1、CXCR4变化。术后SDF-1表达经历先升高后下降的过程,至术后3月已降至术前水平。治疗前后CXCR4表达无明显变化。4.治疗前后纤维化相关指标TGF-β1、MMP-9变化治疗后TGF-β1表达明显下降。重度IUA组、轻中度IUA组、EV 4mg组治疗后明显下降。EV 9mg组治疗前后无显著性差异。治疗后MMP-9表达明显下降。轻中度IUA组、EV 4mg组治疗后明显下降。重度IUA组、EV 9 mg组治疗前后无显著性差异。5.治疗前后子宫内膜容受性指标VEGF、αvβ3变化治疗前后VEGF表达无明显变化。治疗后αvβ3表达明显升高;轻中度IUA组和EV 4mg组治疗后明显升高;但重度IUA组和EV 9mg组治疗前后无显著性差异。结论:宫腔粘连患者经TCRA+术后应用防粘连材料+术后激素治疗综合治疗后,能纠正宫腔形态,抑制内膜纤维化,促进内膜修复创面,显著改善月经状况,并在短期内达到治愈。BMSCs在近期内膜修复过程中起效甚微。不同剂量雌激素对患者卵巢功能影响不同,大剂量雌激素对卵巢功能抑制作用更明显而持久。中等剂量雌激素与大剂量雌激素相比对抑制内膜纤维化、促进内膜修复似乎更具优势。第三章SD大鼠宫腔粘连子宫内膜模型的建立和鉴定目的:建立并鉴定大鼠宫腔粘连子宫内膜模型,与临床标本进行一致性验证,为课题组开展IUA的干细胞移植治疗提供实验基础。方法:1.200-250g未交配雌性SD大鼠10只。造模组左侧子宫用无水乙醇宫腔内注射造模,对照组右侧子宫给予生理盐水做对照。2.于术后三个动情周期处死实验鼠,行HE染色观察子宫内膜组织形态变化;Masson染色了解内膜纤维化程度;WB、q PCR检测ESR1,纤维化相关指标TGF-β1表达情况。结果:1.造模组大鼠左侧子宫内膜腺体稀疏,基质水肿,部分区域肉芽组织样增生,厚度明显薄于对照组。2.造模组Masson染色纤维化面积明显高于对照组。3.造模组ESR1的表达明显高于对照组。4.造模组纤维化相关指标TGF-β1的表达明显高于对照组。结论:1.无水乙醇宫腔内注射可成功有效建立宫腔粘连子宫内膜动物模型,与临床疾病相符,建模成功率100%。2.造模后内膜ESR1、TGF-β1表达升高,与临床疾病相符。